豇豆萌芽期耐冷性综合鉴定与评价
2019-02-13黄海涛徐冬梅谭华强李焕秀
黄海涛，胡 江，徐冬梅，谭华强，李焕秀*
(1．四川农业大学园艺学院，四川 成都 611130; 2．绵阳市农业科学研究院，四川 绵阳 621023)
豇豆是中国重要的蔬菜类型之一，南北各地均可栽培，原产于热带和亚热带地区，是耐热性蔬菜，能耐高温，不耐霜冻，15 ℃以下的温度发芽较差。在长江流域，3-7月份都可以播种，5月下旬至10月份收获，春豇豆提早栽培直播后，遇低温阴雨发芽慢，种子容易发霉腐烂，出苗后遇霜冻容易造成死苗的情况。培育耐低温蔬菜新品种是解决蔬菜低温冷害的有效途径之一。国内外在番茄、黄瓜、茄子、辣椒和西瓜耐低温育种方面已开展了大量的工作[1-8]，在甜瓜、黄瓜、苦瓜和水稻等作物上已建立耐冷性综合评价体系[9-14]。近年来，中国学者开展了少量的豇豆耐冷性评价研究[15-17]，但主要停留在单一指标的评价，对豇豆萌芽期的耐冷性综合评价研究尚未见报道。本研究对50个豇豆萌芽阶段进行14 ℃低温处理，采用主成分分析、隶属函数分析、聚类分析和回归分析法对能够发芽的43个豇豆品种萌芽期耐冷性进行综合性评价，筛选豇豆萌芽期耐冷性评价体系，以期为豇豆耐冷性种质资源的筛选提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试验处理
参试品种50个，种子来自绵阳市农业科学研究院从国内外育种科研单位收集而来并经单株留种提纯的种质资源。每个品种取30粒种子，重复3次，置于铺有2层湿滤纸的培养皿中，浇上水，25 ℃下浸种4 h。将多余的水倒掉，放入光照培养箱中发芽，一组为处理组，温度设置为14 ℃，一组为对照组，25 ℃正常温度发芽。种质资源的名称和来源见表1。
1.2 相关指标测定与计算
播种前统计每个品种的千粒质量，播种后，每隔12 h记录一次萌发数，开始萌发后连续3 d无新增萌发或萌发率为100%时记为萌发结束，常温(25 ℃)下第5天和低温(14 ℃)下第12天分别统计发芽率、胚根长、胚根质量和总鲜质量，计算相对发芽率(RGR)、相对发芽指数(RGI)、相对活力指数(RVI)、相对胚根长(RRL)和相对胚根鲜质量(RRM)、相对总鲜质量(RTM)。
表1 参试材料Table 1 Experiments materials
千粒质量：选取1 000粒饱满种子，称量，测3次重复值，求其平均值。
相对发芽率(RGR)=低温发芽率/正常温度发芽率×100%；相对发芽指数(RGI)=低温下发芽指数/常温下发芽指数×100%；发芽指数(GI)=∑Gt/Dt(Gt为在时间t日的发芽数，Dt为相应的发芽日期)。
相对发芽活力指数(RVI)=低温下发芽活力指数/常温下发芽活力指数×100%
发芽活力指数=发芽率×RL(RL=胚根长)。
相对胚根长(RRL)=低温下胚根长/常温下胚根长×100%；相对胚根鲜质量(RRM)=低温下胚根鲜质量/常温下胚根鲜质量×100%；相对总鲜质量(RTM)=低温下总鲜质量/常温下总鲜质量×100%。
1.3 相关指标的计算
相关指标计算及数据分析方法参照苗永美等[11]的方法。
隶属函数分析：每一品种综合指标得分的隶属函数值用以下公式计算：
μ(xij)=(xij-xjmin)-(xjmax-xjmin)
式中，xij表示i材料在主成分分析中第j个综合指标，xjmin表示i材料在主成分分析中第j个综合指标的最小值，xjmax表示i材料在主成分分析中第j个综合指标的最大值。求出所有品种的综合指标的隶属函数值。对于同一综合指标而言，根据各品种隶属函数值的大小，可以对其耐冷性进行分级。本试验i=1,2,3，…，43；j=1, 2。
权重的确定:根据各个主要综合指标贡献率的大小，用以下公式求出各综合指标的权重。
式中，wj值表示第j个综合指标在所有综合指标中的相对重要程度即权重，pj为主成分分析中第j个综合指标的贡献率，n表示主成分的个数，本试验n=2。
综合评价值计算:根据隶属函数值和权重的计算结果，用以下公式计算各品种的综合耐冷性能的强弱。
式中，Di值为第i材料耐冷性的综合评价值，n表示主成分的个数，本试验n=2。
1.4 数据分析
采用 IBMSPSS 20.0软件对数据进行相关性分析、主成分分析、聚类分析和回归分析，获得各指标的贡献率，逐步回归法建立D值与指标之间的回归方程。利用回归方程计算耐冷性综合评价预测值(VP)。
2 结果与分析
2.1 豇豆萌芽期耐冷性相关性状
调查14 ℃和25 ℃条件下豇豆萌芽期相关性状，计算低温与常温数据的比值，结果见表2。
表2 不同豇豆品种萌芽期耐冷性相关性状指标Table 2 Character indices related to chilling resistance of different cowpea varieties at germination stage
(续表2Continuedtable2)
编号Number千粒质量/gKilo-beans mass GR(25 ℃)/%RGR/%RGI/%RVI/%RRL/%RRM/%RTM/%25165.00±5.0198.89±1.9298.85±1.9946.07±2.1751.19±6.1961.19±8.5657.22±2.1992.79±5.6526210.50±2.17100.00±0.00100.00±0.0044.46±4.4457.44±6.0577.44±9.9972.89±5.5492.38±4.5827136.80±5.2497.78±1.9286.39±3.1630.84±5.8855.64±4.4477.23±6.2270.78±4.4682.92±0.4228142.90±2.40100.00±0.00100.00±0.0047.73±8.7155.55±2.8385.55±6.0682.11±4.9394.21±4.8329174.00±4.45100.00±0.00100.00±0.0045.93±2.6547.95±2.6457.95±2.0941.89±6.3165.13±5.5130150.20±5.37100.00±0.0090.00±3.3342.36±3.2354.37±2.3171.52±6.1157.89±4.8773.58±4.6431151.50±2.95100.00±0.0071.11±8.3924.48±3.1458.96±5.3687.31±1.2280.56±5.4689.75±5.6732151.60±5.5598.89±1.9246.09±2.5214.47±3.8710.07±1.7834.40±3.6737.33±4.2061.92±6.5033185.50±3.92100.00±0.0051.11±5.0917.89±1.8136.97±1.3774.90±5.2070.78±4.0286.67±1.4134177.60±2.3197.78±3.8526.35±8.288.81±2.1123.14±4.8756.78±2.5349.00±5.7464.46±4.5035177.00±6.2697.78±3.8556.67±5.7719.11±4.0128.05±1.5084.05±2.4058.67±6.6771.25±3.443680.50±1.87100.00±0.0095.56±1.9341.95±5.2540.00±0.4470.00±3.2682.00±1.1787.00±4.7537165.50±1.81100.00±0.0080.00±3.3344.68±5.4436.94±4.4592.80±2.1385.67±9.1992.38±4.2638171.00±0.9298.89±1.9270.77±2.2826.38±1.1814.29±4.0220.41±0.7633.56±2.1559.42±4.5639146.70±3.2098.89±1.9270.90±10.3925.38±5.5123.77±7.2733.95±2.6646.11±5.2470.67±6.4640180.60±5.58100.00±0.0090.00±3.3342.00±1.0740.73±2.3255.25±2.9151.44±4.2190.42±3.6941155.30±3.3997.78±3.8560.16±5.6441.11±6.4755.43±4.4075.43±8.5966.44±10.4373.63±4.8742174.00±4.57100.00±0.0051.11±5.0932.60±3.0252.45±2.8390.57±2.6379.78±7.5186.17±2.2943161.50±8.48100.00±0.0075.55±6.9425.23±6.0852.53±2.8866.53±5.5851.67±5.5564.67±1.9544167.50±2.6998.89±1.920.00±0.00-----45119.40±1.08100.00±0.000.00±0.00-----46157.30±4.0698.89±1.920.00±0.00-----47127.80±6.92100.00±0.000.00±0.00-----48156.50±1.73100.00±0.000.00±0.00-----49170.00±3.0498.89±1.920.00±0.00-----50135.70±2.6997.78±3.850.00±0.00-----F值 F values182.180.7396.4320.7644.1969.6425.6816.25F0.053.193.193.193.223.223.223.223.22变化幅度Range80.5～210.597.78～100.00.00～100.008.81～48.817.24～59.8518.10～94.2831.44～85.6742.71～94.21
注：7个品种于14 ℃低温处理下完全未发芽，未统计耐冷性相关性状，结果分析为43个发芽的品种。
Note: 7 cultivars did not germinate under low temperature treatment of 14 ℃,so there isno statistics on the traits related to cold tolerance. The analyses below are based on the 43 varieties that could germinate.
由表2可以看出，各品种千粒质量变幅为80.5～210.5 g，品种间差异显著(F>F0.05)，25 ℃常温处理，所有品种的发芽率都超过了97%，品种间差异不显著(F
2.2 豇豆萌芽期耐冷性性状的相关分析
对43个14 ℃发芽的品种低温胁迫下不同萌芽指标相对值以及千粒质量进行相关性分析，相关系数矩阵见表3。结果表明品种的低温胁迫与常温处理发芽指标的相对值和千粒质量间相关性不显著，6个发芽指标仅仅相对发芽率(RGR)与相对胚根长(RRL)相关性不显著，其他各指标间均呈显著性正相关。说明豇豆萌芽期耐冷性相关性状各指标信息之间存在重叠，直接利用各萌芽期单项指标不能直观、大量评价豇豆的耐冷性，需要在此基础上进一步综合分析。
表3 豇豆不同萌芽指标之间的相关性分析Table 3 Correlation analysis among germination indices of cowpea
注： *和**分别表示在0.05 和0.01 水平上差异显著。
Note:* and ** indicated significant difference atP<0.05 andP<0.01，respectively.
2.3 豇豆萌芽期不同指标主成分分析
用SPSS软件将表2数据相关性显著的萌芽指标RGR、RGI、RVI、RRL、RRM、RTM标准化后进行主成分分析，进一步抽取各主成分的特征向量和累计贡献率，得到样本相关矩阵的特征向量和累计贡献率见表4。结果表明，前2个主成分的贡献率分别为63.819%、17.411%，累计贡献率达到81.230%的信息，理论上，>80%的累积贡献率即认为具有较强的信息代表性，将原来的6个单项指标转换为2个相互独立的综合指标。
表4 各主成分的特征向量及贡献率Table 4 Eigenvectors of principal components(PC) and contribution rate
由表4可见，第1主成分(PC1)6个指标大小基本一致，不同指标对第1主成分都做出了大小相当的贡献。第2主成分(PC2)包含相对发芽率(RGR)、相对发芽指数(RGI)、相对根长(RRL)、相对胚根鲜质量(RRM)等信息，可作为低温发芽和根系生长情况指标。计算出2个主成分的权重分别为0.785 7和0.214 3。
2.4 豇豆萌芽期耐冷性综合评价
根据2个主成分的特征向量及各指标的相对值求出43份材料的2个主成分综合指标(CI)和隶属函数值(μ)， 根据权重和隶属函数值，进一步计算出综合评价值，以D值大小对43份豇豆品种的耐冷性进行排序，结果见表5。
从表6可以看出，参试品种耐冷性综合评价指标D值变化范围为0.113 1～0.905 1。根据D值对43个品种的耐冷性进行排序为：28、26、25、36、37、20、9、1、30、40、29、22、27、5、23、3、18、31、16、41、42、2、43、21、10、17、19、33、24、8、4、39、35、13、38、6、14、11、32、7、15、34、12。
采用最远邻位素Euclidean 距离法对各品种D值聚类分析。聚类分析结果见图1。将参试的43个豇豆的耐冷性可以分为4类，分为Ⅰ类(耐冷型)、Ⅱ类(中度耐冷型)、Ⅲ类(耐冷较差型)、Ⅳ类(冷敏感型)。Ⅰ类(耐冷型)包括7个品种，分别为26、28、20、37、9、36、25；Ⅱ类(中度耐冷型)包括15个品种，分别为3、18、23、5、1、30、22、27、29、40、2、42、16、41、31；Ⅲ类(耐冷较差型)包括12个品种，分别为17、19、10、21、43、13、35、4、39、8、24、33；Ⅳ类(冷敏感型)包括9个品种，分别为7、32、15、34、12、6、14、38、11。
注：CI(1)、CI(2)：分别根据PC1、PC2特征向量计算的综合指标。μ(1)、 μ(2)分别为CI(1)、CI(2)的隶属函数值。D为综合评价值；VP为预测值。
Note:Comprehensive indicators calculated from PC1 and PC2. μ (1) and μ (2) is the membership functions ofCI(1) andCI(2).Dvalue is the comprehensive evaluation value;VPis the predicted value.
2.5 豇豆萌芽期耐冷性逐步回归分析
为更精确分析豇豆的耐冷性与萌芽期各指标相对值的关系，建立豇豆萌芽期耐冷性评价的数学模型。以D值为因变量，萌芽期各调查指标的相对值为自变量，利用SPSS软件进行逐步回归分析，建立最优回归方程：D=-0.357+1.032X2+0.404X3+0.555X6[式中，X2代表相对发芽指数(RGI)，X3代表相对发芽活力指数(RVI)，X6代表相对总鲜质量(RTM)]，方程决定系数(R2)=0.969，P<0.01。由方程可知，5个单项指标中3个指标对豇豆耐冷性都有显著的影响，可以作为豇豆耐冷性的鉴定指标。将萌芽期3个单项指标(RGI、RVI、RTM)相关数据代入回归方程得到预测值(VP)(表5)，对预测值(VP)与综合评价值(D)进行相关性分析，得出它们之间的相关系数(r)=0.984 52，呈极显著的正相关，说明该回归方程对豇豆萌芽期耐冷性评价更直观、简单有效，可用于豇豆的萌芽期耐冷性综合评价。
图1 豇豆萌芽期耐冷性综合评价指标D值聚类Fig.1 Chilling resistance comprehensive evaluation index ofD value cluster for cowpea germination
3 讨论与结论
植物的耐冷性为复杂的数量性状，受多基因控制[17-19]。不同蔬菜品种在低温下萌发能力有显著差异，基因型很大程度上决定种子发芽过程的耐冷性。研究豇豆的冷害、耐冷机制和筛选萌芽期耐冷的种质资源材料时，萌芽期低温的发芽能力、根系活力指标、芽的生长能力及生理生化指标是豇豆耐冷性筛选的重要指标。一些学者在甜瓜、黄瓜、辣椒萌芽期耐冷性评价方法上开展了研究[9，11，20]。在豇豆的萌芽期耐冷性鉴定中目前还没有系统的鉴定和评价体系，在以前豇豆的耐冷性研究中，仅仅使用某些指标的绝对值来比较耐冷性，由于种子成熟度、种子生产期、处理过程、种子生产环境和储藏条件都影响种子对低温的反应，采用单一指标不能消除不同品种本身种子差异的影响，影响结果的准确性[9-10]，本试验所用豇豆种子均为笔者课题组同一年份采种获得，试材均为饱满、成熟度好的种子，各个品种在常温下的种子发芽率均达到97%以上，同时本研究采取低温与常温处理下各指标的相对值进行比较分析，有效消除了种子本身差异造成的误差。本研究发现统计的6个萌芽期相对性状指标都与千粒质量相关性不显著，这与前人在其他作物上的研究结果并不一致[21]，可能与本试验选取研究指标为低温胁迫与常温处理下豇豆品种性状的相对值有关。
本试验对豇豆种子千粒质量及萌芽期低温胁迫下相对发芽率、相对发芽指数、相对发芽活力指数、相对胚根长、相对胚根鲜质量、相对总鲜质量6个耐冷性指标进行相关性分析，并对这萌芽期6个耐冷指标进行综合分析判断，6个指标除相对发芽率与相对胚根长相关性不显著外，其他各指标间均呈显著性正相关，说明6个指标提供的信息有重叠，利用单一指标评价萌芽期耐冷性不可靠。根据主成分的特征向量和各指标的相对值进一步将原来的6个指标转换为独立的2个综合指标，并在此基础上计算出隶属函数值、权重、综合评价值，并对综合评价值进行排序，既利用各指标间内在的深层次的联系，又克服因各项指标的相关性带来的信息重叠导致的误判。利用聚类分析法对D值进行分类，将参试的43个豇豆的耐冷性分为Ⅰ类(耐冷型)、Ⅱ类(中度耐冷型)、Ⅲ类(耐冷较差型)和Ⅳ类(冷敏感型)4类。以D值为因变量，萌芽期各调查指标的相对变化量为自变量建立最优回归方程：D=-0.357+1.032X2+0.404X3+0.555X6，用该方程得到的豇豆耐冷性预测值(VP)与耐冷性综合评价值D值相关性达到显著水平，说明用此方程对豇豆萌芽期耐冷性进行预测准确性较高，可用于下一步开展大量豇豆资源的耐冷性评价和鉴定。
本研究首次在豇豆萌芽期阶段将耐冷性这一主观的、经验的模糊判断分析进行数理统计的定量表达，并对43个品种进行萌芽期耐冷性综合评价，筛选到7个萌芽期耐冷性较好的豇豆品种以及9个极度敏感的豇豆品种。筛选到耐冷种质资源将为下一步开展有性杂交选育耐寒的、适宜春季提早栽培的豇豆品种以及开展豇豆遗传图谱构建和耐冷性状的QTL定位提供重要的亲本来源。
