猪瘟抗体检测试纸研发及制备工艺的优化

孙亚宁，王 丽，王 栋，杨苏珍，陈鑫鑫，刘亚伟，张立林，邓瑞广，张改平,4

(1.河南百奥生物工程有限公司，郑州 450002；2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，郑州 450002；3.郑州大学 材料科学与工程学院，郑州 450001;4.河南农业大学 动物医学院，郑州 450002)

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性传染病，曾在全球多个国家及地区广泛流行，以高热、全身组织弥散性出血为典型症状，急性致死率接近100%[1]，给畜牧业生产造成严重的经济损失[2]，《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020 年)》中将猪瘟列为 5 种优先防治的动物疫病之一。通过扑杀与疫苗预防接种相结合等手段，北美、加拿大、新西兰等很多国家已成功实现猪瘟净化，但中国猪瘟仍是严重危害养猪业的重大传染病之一，存在不间断流行[3]。监测猪瘟抗体能准确掌握猪群的免疫抗体水平，对疫苗免疫效果作出评价，因此，建立一种快速简单的检测方法在猪瘟防控上意义重大。猪瘟抗体检测技术包括病毒中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、正向间接血凝试验(IHA)等，尽管这些方法具有特异、敏感等优点，但不适合在基层广泛推广使用。免疫层析技术是20世纪80年代初期建立的一种基于胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术发展起来的新型免疫分析技术，具有方便、快速、准确、无污染、无需仪器设备及专门技术人员等优点[4]，被广泛应用于医学检测和临床诊断，已成为目前快速检测的主要方法之一。同样，免疫层析技术也被应用于猪瘟抗体检测中，猪瘟抗体检测试纸相继被报道[5-6]，但在实际检测中，猪瘟抗体检测试纸产品的应用并不普遍，究其原因，主要是猪瘟抗体检测试纸的准确性及稳定性备受质疑，在基层使用过程中常常出现假信号及试纸失效等问题，严重制约该方法的推广及应用[7]。关于猪瘟抗体试纸的报道重点在于蛋白的选择及制备试纸基本条件的建立，而对于保护剂及稳定性等问题没有深入研究[5,8]。猪瘟抗体检测试纸采用直接法检测模式：将胶体金标记的猪瘟病毒蛋白喷涂于胶金垫上(玻璃纤维膜)，能与猪瘟抗体结合的二抗(检测线)及抗猪瘟病毒蛋白的多抗(质控线)喷涂在硝酸纤维素膜上(NC膜)，样品垫则提供整个反应所必须的缓冲系统。以上这些组分中金标蛋白的缓冲液、胶金垫的处理液、喷膜蛋白的稀释液及样品垫的缓冲液，每一个环节的处理试剂都具有不同的作用，都决定着成品试纸检测的准确性、灵敏度及货架期。本研究对猪瘟抗体检测试纸中各个环节的稳定剂进行优化，筛选出一套适合于猪瘟抗体检测试纸的稳定剂，并使猪瘟抗体检测试纸的准确性、灵敏度及稳定性满足商品化需求，为猪瘟抗体检测试纸能广泛应用于基层猪瘟抗体检测奠定基础，为中国实现猪瘟净化做出贡献。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 主要试剂耗材 Erns-E2 重组蛋白、抗 Erns-E2 重组蛋白单克隆抗体、CSFV 抗体标准阳性血清和CSFV 抗体标准阴性血清均由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室制备；重组金黄色葡萄球菌 A 蛋白(r-SPA)购于杭州纽龙生物科技有限公司；氯金酸和酪蛋白为美国Sigma公司产品；牛血清白蛋白(BSA)为美国 Amresco公司产品；Tween 20为美国默克公司产品；PVP-10、PEG20000和Tris为美国 Solarbio 公司产品；Triton X-100为美国 Merck 公司产品；海藻糖为日本 Wako 公司产品。硝酸纤维素膜(HF13502S25,30 cm×2 cm)、玻璃纤维垫和吸水纸为英国 Millipore 公司产品；氢氧化钠和叠氮钠等其他试剂为国内市售分析纯级。

1.1.2 主要仪器 93-3定时恒温双向磁力搅拌器购自上海亚荣生化仪器厂；电热鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司；HGS802压壳机购自杭州峰航科技有限公司；900型薄膜连续封口机购自广州华丰包装设备有限公司；SIGMA4-16K离心机为德国Sigma公司产品；加热磁力搅拌器为德国IKA公司产品；U-3000 紫外可见分光光度计为日本岛津产品；BioDot-XYZ3060三维喷点系统、BioDot-CM 4000斩切机和BioDot-TSR3000读条仪为美国 Bio-Dot公司产品。

1.2 方 法

猪瘟抗体检测试纸由支撑底板、层析膜、金标蛋白垫、样品垫和吸水垫5部分构成(图1)，样品垫由玻璃纤维棉经样品垫处理液浸泡干燥后制成；金标蛋白垫由玻璃纤维棉固定金标Erns-E2重组蛋白制成；层析膜为硝酸纤维素膜，其上固定有SPA形成的“检测线”印迹，固定抗Erns-E2重组蛋白单克隆抗体形成“质控线”印迹，用以拦截金标的免疫复合物形成肉眼可见的信号；吸水垫由吸水纸板制成，主要吸收流过层析膜的待检样品溶液，为虹吸反应提供动力[9]。

图1 猪瘟抗体检测试纸结构Fig.1 Schematic of immunochromatographic test strip for detection of CSFV-specific antibody

1.2.1 胶体金制备及鉴定 参照Frens[10]的研究方法，以柠檬酸三钠为还原剂制备胶体金。取100 mL超纯水于500 mL烧杯中，加入1 mL 10 g/L 氯金酸加热煮沸，然后在加热搅拌状态下加入1.6 mL 10 g/L柠檬酸三钠，观察颜色由无色→蓝色→深红色→亮红色，直至颜色不再发生改变时停止加热，自然冷却后用超纯水定容至100 mL，4 ℃保存。肉眼观测胶体金状态，使用紫外可见分光光度计进行光谱扫描，测定最大吸收波长及吸光值，并用透射电镜观察胶体金状态，估测粒径。

1.2.2 胶体金标记Erns-E2重组蛋白 胶体金标记Erns-E2重组蛋白条件优化：取纯化后的Erns-E2重组蛋白，用微量分光光度计测定蛋白浓度。胶体金分别用0.2 mol/L K2CO32、4、8、12 μL/mL调节pH，按照范国英等[11]所述方法测定各pH下最佳蛋白标记量。取每个pH对应的胶体金2管(每管1 mL)，按照2、4、8、12 μL/mL的顺序标号为1、2、3、4、5、6、7、8，将对应的最适量蛋白均匀加入胶体金中，充分混匀后室温静置反应70 min，1、3、5、7号胶体金标记蛋白用100 μL 100 g/L BSA溶液封闭，2、4、6、8号胶体金标记蛋白用100 μL 50 g/L酪蛋白溶液封闭，反应10 min，12 000 r/min离心25 min，弃上清，沉淀用200 μL金标蛋白保存液重悬，观察重悬金标蛋白的状态，并按照经验选择测试环节以外的其他参数，如本部分优化胶体金标记方法，则按照经验选择样品垫、金标垫及喷膜量等参数组装试验用试纸(方法下同)，在试纸的金标垫上点不同标记方法标记的金标蛋白，每条2 μL，分别检测 1∶200 倍稀释的标准阴性血清，确定有无非特异性反应，检测标准阳性血清效价，观察对试纸灵敏度的影响，从而确定较优标记条件。

金标蛋白保存液优化：根据选出的金标蛋白条件标记，取胶体金(每管1 mL，共5管)按选出的标记方法标记、封闭并离心，然后分别用200 μL 1～5号金标蛋白保存液(配方见表1)重悬沉淀，将金标蛋白溶液在室温环境下放置1周，观察金标蛋白状态，并组装试验用试纸，在试纸的金标垫上点不同重悬液重悬的金标蛋白，每条2 μL，分别检测1∶200倍稀释的标准阴性血清，确定有无非特异性反应，检测标准阳性血清效价，观察对试纸灵敏度的影响，选择能保持金标蛋白稳定、检测阴性样品无非特异性且灵敏度好的为试纸金标蛋白保存液配方。

表1 金标蛋白保存液配方Table 1 Formulationsofcolloidal gold-labeled protein preservation solution

金标蛋白大量制备：取胶体金40 mL加入80 μL 0.2 mol/L K2CO3，在搅拌状态下逐滴加入Erns-E2重组蛋白(超纯水稀释为1 mg/mL)480 μL，搅拌均匀后室温反应70 min，然后在搅拌状态下逐滴加入4 mL 50 g/L酪蛋白溶液，搅拌均匀后室温反应10 min，12 000 r/min离心25 min，弃上清，沉淀用8 mL 4号金标蛋白保存液重悬，4 ℃保存，备用。

金标蛋白垫制备：将金标蛋白按照4、6、8、10 μL/cm的量喷涂在金标垫上，45 ℃干燥1 h，组装试验用试纸。检测1∶200倍稀释的标准阴性血清，确定有无非特异性反应，检测标准阳性血清效价评价，试纸灵敏度，选择灵敏度达到1∶25 600的最少喷涂量为金标蛋白喷涂量，喷涂金标蛋白于胶金垫上，45 ℃干燥1 h，加干燥剂密封保存，备用。

1.2.3 检测膜制备 检测线(T线)最佳喷涂条件确定：每份取SPA粉末1 mg，共4份，分别用生理盐水、PBS、CBS、0.1 mol/L Tris-HCL缓冲液溶解为1 mg/mL的溶液，喷于135NC膜上，42 ℃ 干燥2 h，然后组装试验用试纸，检测标准阳性血清效价，选择灵敏度较高组对应的缓冲液为检测线稀释液。然后称取SPA粉末1 mg，用选取的检测线稀释液分别稀释成2、1和0.5 mg/mL，喷膜42 ℃干燥2 h，然后组装试验用试纸，检测标准阳性血清效价，选择灵敏度达到1∶25 600对应的最低SPA质量浓度即为检测线所喷质量浓度。

质控线(C线)最佳喷涂条件确定：取抗Erns-E2重组蛋白单克隆抗体，用PBS稀释为2、1和0.5 mg/mL，以1 μL/cm的量喷于135NC膜上为C线，同时喷涂T线(最佳参数)，42 ℃干燥2 h，然后组装试验用试纸，检测标准阳性血清效价，选择C线清晰，且不随检测样品浓度改变而改变的最低质量浓度为质控线喷涂量。

1.2.4 样品垫制备 取玻璃纤维棉切割成1.8 cm×30 cm大小，分别浸泡于表2的不同配方中5 min，然后于42 ℃干燥4 h，分别与制备好的试纸各组份组装成试纸，检测试纸灵敏度，确定较优配方。

表2 样品垫缓冲液配方Table 2 Formulation of buffer systems for sample pad

1.2.5 试纸组装与切割 分别将检测膜、金标垫、样品垫和吸水垫按图1所示依次粘贴于支撑板上，且各组份连接处应有2 mm重叠，然后使用切割机切割成2.8 mm×60 mm的试纸，显色区应平整无压痕，然后装壳，装袋，加干燥剂密封。

1.2.6 试纸稳定性检测 包装好的猪瘟抗体检测试纸于45 ℃保存，进行加速稳定试验，45 ℃下保存37.5 d相当于25 ℃下保存1 a，30 ℃下保存6个月[9]。分别在4、8、12、16、20周取样检测试纸灵敏度，从而确定试纸保质期。

2 结果与分析

2.1 胶体金质量鉴定

肉眼观测制备的胶体金呈酒红色，颜色透亮、无沉淀及漂浮物；紫外可见分光光度计扫描最大吸收峰为526 nm；透射电镜下形状较规则，随机测量20个颗粒，平均粒径为26 nm左右(图2)，适合免疫层析检测。

2.2 胶体金标记Erns-E2重组蛋白条件确定

由表3可知，4号金标蛋白透亮无沉淀，检测阴性样品无非特异性反应，检测阳性样品效价可达1∶25 600，所以最终确定最佳条件为：1 mL胶体金中加入0.2 mol/L K2CO34 μL调节pH，然后加入12 μg的Erns-E2重组蛋白，室温搅拌反应70 min，加50 g/L酪蛋白溶液100 μL，室温封闭10 min，12 000 r/min离心25 min，弃上清，沉淀用金标蛋白保存液重悬。

图2 胶体金电镜扫描结果Fig.2 Thecolloidal gold particles scanned by electron microscope

2.3 金标蛋白保存液

从图3可以看出，1、2和3号重悬金标蛋白稳定性差，已经板结无法用于检测，4和5号重悬金标蛋白状态稳定，酒红色透亮无沉淀，可用于检测；每条点金2 μL，检测1∶200倍稀释的标准阴性血清及标准阳性血清效价(表4)。

表3 Erns-E2重组蛋白胶体金标记条件的优化Table 3 Optimization of colloidal gold labeling conditions of Erns-E2 recombinant

结果显示5号保存液重悬的金标蛋白稳定性和检测灵敏度优于1～4号，且无非特异性反应，所以确定金标蛋白保存液配方：Na2B4O7·10H2O 30.5 g/L，BSA 10 g/L，蔗糖50 g/L，Triton X-100 5 g/L，NaN30.3 g/L，溶液为超纯水。

2.4 金标蛋白垫制备

由表5可知，金标蛋白喷涂量为6 μL/cm时试纸已经达到所需检测灵敏度，因此将金标蛋白以6 μL/cm的量喷涂在玻璃纤维棉上，45 ℃干燥1 h制备金标垫。

图3 金标蛋白保存液稳定性Fig.3 Stability of colloidal gold-labeled protein in different preservation solutions

保存液Preservation solutions金标蛋白状态Gold-labeled protein status阴性样品Negative sample灵敏度Sensitive1深紫色,板结 Purple,hardening//2深紫色,板结 Purple,hardening//3深紫色,板结 Purple,hardening//4酒红色,透亮,无沉淀 Wine,clear,no precipitate-1∶6 4005酒红色,透亮,无沉淀 Wine,clear,no precipitate-1∶12 800

注：“/”表示未检测；“-”表示阴性结果。下同。

Note:“/” undetected;“-” negative results.The same below.

表5 金标蛋白喷涂量的选择结果Table 5 Optimization of quantity of colloidal gold-labeled protein in conjugate pads

2.5 检测膜的制备

2.5.1 检测线(T线)的制备 检测线蛋白缓冲液检测结果与生理盐水、PBS、CBS为缓冲液时检测结果相似，试纸灵敏度均达到1∶12 800，使用0.1 mol/L Tris-HCL为缓冲液时显色较好，试纸灵敏度可达1∶25 600。因此选择使用0.1 mol/L Tris-HCL缓冲液稀释SPA并优化喷膜质量浓度，结果显示，当喷膜质量浓度为1 mg/mL时试纸检测标准阳性血清效价已达1∶25 600，因此检测线处理用0.1 mol/L Tris-HCL配置的1 mg/mL 的SPA溶液，以1 μL/cm的量喷涂135NC膜，42 ℃干燥2 h。

2.5.2 质控线(C 线)的制备 取抗Erns-E2重组蛋白单克隆抗体，用PBS稀释为 2、1和 0.5 mg/mL，以 1 μL/cm 的量喷涂于 135NC 膜上为 C 线、同时喷涂 T 线(最佳参数)，42 ℃干燥 2 h，然后组装试纸，检测标准阳性血清效价，结果显示，当单抗质量浓度达1 mg/mL 时 C 线清晰，且不随检测样品质量浓度改变而变化，因此选择抗 Erns-E2 重组蛋白单克隆抗体质量浓度为 1 mg/mL 喷涂质控线。

2.6 样品垫的制备

样品垫主要提供检测反应所需环境，合适的样品垫可以避免假信号、增加检测灵敏度及稳定性，对试纸灵敏度及稳定性影响很大，根据 6 种配方制备的样品垫制备试纸检测 CSFV 抗体标准阳性血清，结果显示配方 5 试纸检测灵敏度最好，效价可达1∶25 600，因此确定 CSFV 试纸样品垫处理液配方为：酪蛋白 10 g/L，Triton X-100 5 g/L，NaN30.3 g/L，溶液为 0.1 mol/L PBS。

2.7 试纸稳定性

将包装好的猪瘟抗体检测试纸于 45 ℃保存，进行加速稳定试验，结果见表 6，试纸在 45 ℃保存16 周时试纸灵敏度出现明显的下降，因此试纸可以在 45 ℃条件下稳定保存 12 周，相当于 25 ℃保存 2 a，30 ℃下保存 14个月，考虑温度的变化和可能遇到的恶劣环境，因此产品保质期确定为 1 a。

表6 猪瘟抗体检测试纸稳定性Table 6 Stability of CSFV-specific antibody detection strip

3 讨 论

制备高质量的猪瘟抗体检测试纸具有很多关键点，虽然基础是有好的抗原及抗体，但在制备试纸的过程中，每一个环节都将影响试纸最后的灵敏度、准确性及稳定性[12]。针对猪瘟抗体检测试纸，本研究在胶体金标记时进行 pH、封闭蛋白及保存液的优化，发现胶体金标记抗原时应选择中性稍偏碱的缓冲液可以大大提高标记效率，标记后选用酪蛋白封闭，可以降低试纸的非特异性；金标蛋白保存液在碱性离子环境及较高糖浓度时，更有利于金标抗体稳定，选用 BSA 为蛋白保护剂比酪蛋白更有利于抗原抗体反应，提高试纸灵敏度。在样品垫制备中分别优化保护蛋白、表面活性剂及缓冲液，结果发现中性的 PBS 缓冲液、Triton X-100及 BSA 更有利于抗原抗体反应，制备的试纸灵敏度更好，表面活性剂 Tween-20 加入样品垫会降低样品垫的黏附性，不利于样品垫在底板上的固定，同时会增加试纸的假阳性反应。

4 结 论

本研究对猪瘟抗体检测试纸制备的各环节，特别是产品缓冲系统中的稳定剂进行优化，确定猪瘟抗体检测试纸产品化的具体参数，为猪瘟抗体检测试纸的产业化奠定基础。猪瘟抗体检测试纸的较优参数如下：胶体金平均粒径为 26 nm；胶体金标记 Erns-E2 重组蛋白时最佳 pH为中性稍偏碱，此时的蛋白标记效率较高，且稳定性好；蛋白最佳标记条件为 1 mL 胶体金加入 12 μg 的 Erns-E2 重组蛋白，金标蛋白选用酪蛋白封闭可以有效减低试纸的非特异性，金标蛋白保存液选用 Na2B4O7·10H2O提供碱性环境，加入 BSA 10 g/L、蔗糖50 g/L、Triton X-100 5 g/L和 NaN30.3 g/L能更有效地保护金标蛋白的活性及稳定性；因为检测对象为生理盐水稀释的血清，因此样品垫处理时较为简单的 pH 中性配方为 0.1 mol/L PBS溶液含酪蛋白 10 g/L、Triton X-100 5 g/L、NaN30.3 g/L，可以获得较好的检测灵敏度和准确性。