小鼠Na+-K+-2Cl-共转运蛋白基因启动子克隆及20-HETE对其转录活性的影响

武晶晶，孔令慧，贾茹

（中国医科大学生命科学学院 1. 医学遗传学教研室； 2. 生物科学系，沈阳 110122）

Na+-K+-2Cl-共转运蛋白（Na+-K+-2Cl-cotransporter，Nkcc2）基因编码的呋塞米敏感的Na+-K+-2Cl-共转运蛋白是溶质转运体超家族成员之一，因此编码该蛋白的基因也被称为SLC12A1［1-2］。NKCC2蛋白主要分布在肾脏髓袢升支粗段，可将2个Cl-、1个Na+和1个K+同向转运到细胞内，参与肾脏近30% Na+的重吸收［3］，是重要的高血压候选基因之一。

细胞色素P450 4F2编码的ω-羟化酶，可将花生四烯酸代谢生成二十羟基二十炭四烯酸 （20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）［4］，是重要的血压调节因子。前期本课题组成功地构建了CYP4F2转基因小鼠，并证明转基因小鼠肾脏CYP4F2蛋白表达增加，20-HETE合成增多，是研究20-HETE对血压调控机制的重要动物模型［5］。在对转基因小鼠的研究［6］中发现，转基因小鼠肾脏Nkcc2蛋白和mRNA表达均显著低于野生型小鼠，推测20-HETE在基因转录水平对Nkcc2存在调控作用。本研究通过构建小鼠Nkcc2基因启动子萤光素酶报告基因载体，利用20-HETE刺激转染了Nkcc2启动子报告基因载体的HEK-293T细胞，检测该报告基因的转录活性，初步分析20-HETE对Nkcc2基因启动子活性的影响，为阐明20-HETE对Nkcc2基因调节作用的分子机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、Taq DNA polymerase、LA Taq DNA polymerase、DNA marker、T4 DNA连接酶、KpnⅠ和Hind Ⅲ限制性内切酶、琼脂糖均购自日本TaKaRa公司，DMEM高糖培养基、胎牛血清购自美国HyClone公司，人类胚胎肾细胞系HEK293T细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所，胰蛋白酶购自美国Biosharp公司，萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic、海参萤光素酶载体pRL-TK、Dual-GloTM双萤光素酶检测系统购自美国Promega公司，胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉购自美国Sigma-Aldrich公司，胶回收、质粒制备试剂盒购自美国Axygen公司，脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，20-HETE购自美国Cayman公司，引物合成由中国南京金斯瑞生物科技有限公司完成，DNA测序由中国沈阳优唯生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析：应用生物信息学软件ALi-Baba 2.1和TRANSFAC TESS，对小鼠Nkcc2基因启动子区-1 474 bp～+1 bp序列进行预测，比对2个软件的分析结果，寻找潜在的顺式作用元件。

1.2.2 小鼠Nkcc2基因启动子的克隆：

1.2.2.1 小鼠基因组DNA提取与引物设计 取FVB/N小鼠鼠尾，常规方法提取小鼠基因组DNA，-20℃保存。根据Gen Bank数据库获得小鼠Nkcc2基因启动子的DNA序列，利用primer 5.0设计一对特异性引物P1和P2，PCR产物的长度为1 502 bp （-1 462 bp ～+40 bp） 。设计引物：上游引物5’-GTCACCAATTTACCTTT CCCTT-3’；下游引物5’-ACTTACCGCCCCATCCAG-3’。

1.2.2.2 启动子片段扩增及TA克隆 以小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物经电泳鉴定，并利用胶回收纯化试剂盒回收纯化，纯化后的PCR产物连接到pMD-18T载体，16 ℃连接过夜。连接产物转化JM109型感受态细胞，涂布于LB琼脂板，进行蓝白斑筛选。挑取白色克隆于含有氨苄西林的LB培养液中扩增，经菌液PCR鉴定DNA片段插入方向，质粒提取试剂盒提取质粒，经DNA双向测序验证，正确的重组载体命名为pMD18-Nkcc2。

1.2.2.3 小鼠Nkcc2启动子萤光素酶报告基因载体的构建 pMD18-Nkcc2重组载体经KpnⅠ和Hind Ⅲ双酶切，酶切产物经电泳鉴定，并利用胶回收纯化试剂盒回收纯化后，插入到pGL3-Basic载体，16 ℃连接过夜，转化JM109型感受态细胞，挑取单克隆菌落于含有Amp的LB培养液中扩增，试剂盒提取质粒经双酶切及双向测序鉴定，正确的重组载体命名为pGL3-Nkcc2。

1.2.3 小鼠Nkcc2基因启动子活性检测：

1.2.3.1 细胞培养及处理 人类胚胎肾细胞系HEK293T细胞常规培养于含10%胎牛血清，100 U /mL青霉素，100 U /mL链霉素的DMEM高糖培养基中，37 ℃、5% CO2及饱和湿度的条件下培养，用含0.1%胰蛋白酶的消化液消化传代。

1.2.3.2 转染 转染前1 d，用无抗生素培养基接种HEK293T细胞于24孔培养板中，接种密度以24 h后细胞增长至50%～70%为宜，分别用无血清无抗生素的培养基配置质粒DNA （小鼠Nkcc2启动子萤光素酶报告基因质粒及海参萤光素酶对照质粒） 和脂质体LipofectamineTM2000，两者混合后室温孵育20 min，加入24孔培养板培养基中转染HEK293T细胞。细胞转染24 h后，用终浓度为1 μ mol/L 20-HETE刺激2 h。

1.2.3.3 Dual-GloTM双萤光素酶检测系统检测荧光素酶活性 依据试剂盒说明书PBS洗涤细胞后，加入100 μ L 1×PLB裂解细胞，室温震荡15 min，将10 μ L细胞裂解液移入萤光素酶检测管中，每管加入35 μ L LAR Ⅱ，利用生物发光仪检测萤火虫萤光强度值，每管再加入35 μ L Stop-reagent，检测海参萤光强度值，计算相对荧光值。

1.3 统计学分析

实验数据均由3次独立实验结果的表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠Nkcc2基因启动子区的生物信息学分析

登录美国国家生物技术信息中心Gen Bank下载小鼠Nkcc2基因启动子区1 474 bp序列，应用生物信息学软件AliBaba2.1和TRANSFAC TESS分析小鼠Nkcc2基因启动子区结构 （-1 474 bp～+1 bp） ，该区域存在多个顺式作用元件，其中NF-κ B、AP-1等均与20-HETE调控靶基因转录活性相关，是20-HETE调控Nkcc2基因的潜在作用元件，见图1。

图1 小鼠Nkcc2基因启动子区潜在转录因子结合位点Fig.1 Transcription factor binding site of the murine Nkcc2 gene promoter region

2.2 Nkcc2基因启动子萤光素酶报告基因载体的构建

以小鼠基因组DNA为模板，利用PCR扩增小鼠Nkcc2基因启动子片段 （-1 462 bp ～ +40 bp） ，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小与预期相符（图2） 。将PCR产物克隆至中间载体pMD18-T vector中，经PCR、双向测序及BLAST比较分析，鉴定出与GenBank序列一致的pMD18-Nkcc2重组载体，经限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切，回收目的短片段，插入到经KpnⅠ和HindⅢ双酶切的无启动子萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic上。重组载体pGL3-Nkcc2经Kpn I和Hind Ⅲ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析，可见1 502 bp的阳性插入片段 （图3） ，且测序结果 （图4） 与GenBank序列一致，证明用于分析Nkcc2启动子活性的萤光素酶报告基因载体构建成功。

2.3 20-HETE对Nkcc2基因启动子活性的影响

图2 小鼠Nkcc2基因启动子PCR产物电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR-amplified murine Nkcc2 gene promoter fragmen

为验证20-HETE对Nkcc2基因启动子转录活性的调控作用，将pGL3-Nkcc2萤光素酶报告基因载体瞬时转染到HEK293T细胞24 h后，用1 μ mol/L 20-HETE刺激2 h，并利用萤光素酶报告基因系统检测Nkcc2基因启动子转录活性。与对照组相比，20-HETE处理组Nkcc2基因启动子转录活性下降了27.5% （P＜ 0.05） ，说明20-HETE可有效下调Nkcc2基因启动子转录活性，初步验证了假设。

图3 重组质粒双酶切鉴定电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of the recombinant plasmid digested by restriction endonuclease

3 讨论

原发性高血压是当今医学领域最具挑战性的心血管疾病之一，也是全球范围内重大公共问题。血压调节是一个多系统多环节的复杂过程，其中肾小管Na+重吸收作用通过调节机体水钠代谢，参与血压调节。Nkcc2基因编码的Na+-K+-2Cl-共转运体主要分布在肾脏髓袢升支粗段，参与肾小管Na+的重吸收，因此该基因是重要的高血压候选基因。

图4 重组质粒双向测序结果Fig.4 Bidirectional sequencing of the recombinant plasmid

CYP4F2是另一个重要的高血压候选基因，该基因编码的ω-羟化酶是人类肾脏产生20-HETE最重要的酶之一。20-HETE主要由髓袢升支粗段生成，通过抑制Nkcc2发挥利尿钠作用，然而其具体机制尚不清楚。有报道［7-8］称20-HETE通过抑制ROMK活性，减少Nkcc2转运所需K+浓度差的势能，间接抑制Nkcc2的活性。本课题组前期利用4% NaCl的高盐饲料喂养具有高20-HETE水平的CYP4F2转基因小鼠，发现20-HETE与高盐有协同作用，通过经典的泛素-蛋白酶体系统降解肾脏Nkcc2蛋白，证明了20-HETE通过翻译后调控机制参与肾脏Nkcc2蛋白表达的调控。本研究中还发现，正常饮食CYP4F2转基因小鼠肾脏Nkcc2蛋白和mRNA表达均低于同组野生型小鼠，推测20-HETE在基因转录水平对Nkcc2表达亦存在调节作用。虽然，目前尚未有直接证据证明20-HETE对Nkcc2基因表达存在调控作用，但仍有一些报道从侧面支持本研究的结论。在对盐敏感性高血压动物模型Dahl盐敏感性大鼠的研究［9-12］中发现，Dahl盐敏感性大鼠内源性20-HETE水平较低是引起盐敏感性高血压的主要原因；对Dahl盐敏感性大鼠肾脏水钠代谢相关通道蛋白表达谱的研究［13］发现，Dahl盐敏感性大鼠肾脏Nkcc2蛋白表达及活性均高于其他种类大鼠；而利用Clofibrate外源性诱导20-HETE合成增加可恢复Dahl盐敏感性大鼠肾脏Nkcc2至正常水平［9-10］，以上结论均间接说明了20-HETE对Nkcc2的表达存在调控作用。

结合本课题组的前期工作基础和其他实验室关于20-HETE对Nkcc2作用机制的研究，推测20-HETE在转录水平存在对Nkcc2基因表达的调节作用。为探讨20-HETE对Nkcc2基因转录调控的作用机制，利用生物信息学软件分析小鼠Nkcc2基因启动子区-1 474 bp ～+1 bp序列，发现该区域存在多个20-HETE调控基因转录的潜在作用元件，如NF-κ B、AP-1等。进一步构建了小鼠Nkcc2基因启动子区萤光素酶报告基因载体pGL3-Nkcc2。20-HETE刺激转染了pGL3-Nkcc2载体的HEK293T细胞后，通过萤光素酶报告基因系统检测Nkcc2基因启动子转录活性，结果显示，20-HETE能有效减少pGL3-Nkcc2重组载体转录活性，初步判断20-HETE在转录水平下调Nkcc2基因的表达。

综上所述，本研究成功构建了小鼠Nkcc2基因启动子区重组报告基因载体pGL3-Nkcc2，为进一步探究20-HETE对Nkcc2基因的调控机制提供了有利的研究工具。同时，本研究发现20-HETE对pGL3-Nkcc2重组载体转录活性存在抑制作用，为进一步鉴定20-HETE对Nkcc2基因表达调控的分子机制奠定了实验基础。