甘蔗与斑茅BC1分子鉴定、抗黑穗病和花叶病初步评价

吴小斌, 王勤南, 凌秋平, 杨湛端, 陈勇生, 黄俊坚, 吴嘉云, 李奇伟



甘蔗与斑茅BC1分子鉴定、抗黑穗病和花叶病初步评价

吴小斌, 王勤南, 凌秋平, 杨湛端, 陈勇生, 黄俊坚, 吴嘉云*, 李奇伟*

[广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所), 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广州 510316]

为了解甘蔗()与斑茅()杂交后代作为抗病亲本的利用价值，通过特异引物PCR鉴定出78份甘蔗与斑茅杂交BC1真实杂种; 通过人工接种花叶病毒和黑穗病菌，初步评价了甘蔗和斑茅杂交BC1的抗病表现。结果表明，甘蔗和斑茅杂交BC1的抗花叶病具有普遍性，而黑穗病抗性则出现分离。初步筛选出BC1无性系YCE01-48、YCE01-71、YCE01-105、YCE01-125、YCE02-184和YCE01-118可同时抗花叶病和黑穗病，有望成为甘蔗杂交利用的高抗病源亲本。

甘蔗; 斑茅; 分子鉴定; 抗病

甘蔗()育种历史与抗病育种密不可分，利用野生种质资源创制优异新亲本是目前广泛应用的甘蔗育种方法。20世纪初，荷兰育种家Jesweit首次提出“甘蔗高贵化育种”，并通过将热带种与爪哇割手密()杂交、回交，实现甘蔗抗花叶病育种[1]。现代甘蔗品种只含有少数种质资源的血缘，狭窄的遗传基础造成后代群体变异不足，成为甘蔗品种遗传改良的瓶颈[1–3]。因此，充分挖掘利用甘蔗野生种质资源、拓宽甘蔗遗传基础成为提高甘蔗选育种效率的重要途径。

斑茅()隶属于禾本科(Graminaceae)蔗茅属，具有抗逆强、分蘖多、宿根性好、生长力旺盛、适应性广等优异性状，具有改良现有甘蔗品种农艺性状的潜力，所以倍受世界各国育种家重视[2,4–5]。1885年，Soltwedel首次提出甘蔗与斑茅杂交的想法；1941年，Janaki-Ammal利用甘蔗属热带种和斑茅杂交，成功得到杂交后代[6]。1956年，我国海南甘蔗育种场开展相关研究，于1973年育成第一个真杂种F1崖城73-07，经染色体Giemsa-C带分带和过氧化物酶同工酶电泳分析鉴定确认含有斑茅血缘[7–9]；至2001年，成功应用甘蔗与斑茅F1与甘蔗回交获得真实的BC1，此后陆续获得更高代无性系[10]，为斑茅种质资源利用提供宝贵资源。

甘蔗与斑茅杂交后代优异性状备受瞩目，在斑茅杂交利用育种进程中，有许多已报道的杂交后代被鉴假，且有关杂交后代的抗病性评价鲜有报道, 因此对甘蔗与斑茅杂交后代的真实性鉴定与抗性评价尤为重要。本研究利用鉴定斑茅后代的特异引物EF1/ER1[10]对甘蔗与斑茅杂交BC1进行分子鉴定，并进行抗黑穗病和抗花叶病初步评价，为斑茅在甘蔗种质创新利用研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 甘蔗与斑茅BC1真实杂种分子鉴定

试剂和供试材料 DNA提取试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司，Taq™ Version 2.0扩增酶、DNA Marker购自TaKaRa公司，琼脂糖粉末购自BIOWEST公司，引物合成由赛默飞世尔科技(中国)有限公司完成。供试无性系为广州甘蔗糖业研究所海南甘蔗育种场创制的甘蔗与斑茅的BC1，以斑茅原种、甘蔗热带种Badila为对照，采集地点为广东省翁源县蔗区，取植株+1叶，用无菌水清洁叶片后保存于–80℃。

DNA提取和PCR鉴定 甘蔗叶片总DNA提取采用改良CTAB法，即取100~200 mg甘蔗叶片于液氮中迅速研磨至粉末，加入900L预热至65℃的DNA提取缓冲液和100L无水乙醇，混匀后65℃水浴60 min以充分裂解细胞。10 000×离心5 min后取上清液，依次加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)分别抽提1次，加入等体积-20℃预冷的异丙醇沉淀DNA，离心后沉淀用75%的乙醇洗2次、无水乙醇洗1次，风干后溶于100L无菌水，加1L RNase A, 并于37℃水浴45~60 min，后于–20℃保存备用。所提DNA均用Biophotometer生物分光光度计测定OD值和琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性。PCR反应体系为25L，包含12.5L 2×premix, 上下游引物各1L，0.5L总DNA和10L无菌水。引物EF1: 5′-GGAA­GAAAG­AAAAC­AAGGGT-3′, ER1: 5′-GGGACGG­MCMA­AACAA­AAT­­T-3′[11]。PCR扩增程序为95℃预变性5 min；93℃变性50 s，54℃退火20 s，72℃延伸40 s，共35个循环；72℃延伸5 min。PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带317 bp。每样品3次生物学重复。

1.2 抗黑穗病评价

材料 接种源为广东省翁源县蔗区不同田块不同品种随机采集黑穗鞭子混合，收集后风干并将黑穗孢子过筛后保存于4℃。供试无性系为广州甘蔗糖业研究所海南甘蔗育种场创制的37份甘蔗与斑茅的BC1，以F134、NCo310和YC71-374为对照。

评价方法 抗性鉴定参考《NY/T 1786-2009 农作物品种鉴定规范, 甘蔗》[12]中的抗黑穗病评价方法。具体操作为: 甘蔗黑穗病孢子用自来水(加少量吐温-20作为表面活化剂)调配成孢子浓度约为5×106cfu mL–1的悬浮液，且孢子活力>80%。将种茎置于孢子悬浮液10 min，于25℃~28℃下保湿(24±2) h，促进孢子萌发并侵入蔗芽。保湿结束后，种植于田间，常规管理。试验采用随机区组设计,单行区，行长5.0 m，行距1.1 m，设3个重复，每小区每品种50个芽，6月中旬接种；待第1个黑穗病鞭子长出后，每隔14 d调查1次新长出的鞭子数，直到12月中旬为止。本试验于广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所)翁源甘蔗育种基地新陂村试验田进行。

分级标准 依据农业部“九五”攻关项目病害的统一分级标准[13]划分为9级，1级为高抗(HR), 发病率为0~3.00%；2级和3级均为抗性(R), 发病率分别为3.01%~6.00%和6.01%~9.00%；4级为中抗性(MR), 发病率为9.01%~12.00%；5级均为中感(MS), 发病率为12.01%~25.00%；6级和7级均为感病(S), 发病率分别为25.01%~35.00%和35.01%~ 50.00%；8级和9级均为高感(HS), 发病率分别为50.01%~75.00%和75.01%~100.00%。

1.3 抗花叶病评价

材料 接种源为广东省翁源县翁源蔗区不同田块不同品种随机采集带花叶病症状植株+1叶。供试无性系为广州甘蔗糖业研究所海南甘蔗育种场创制的62份甘蔗与斑茅的BC1，以ROC22为对照。

评价方法 参考《NY/T 1786-2009农作物品种鉴定规范, 甘蔗》[12]抗花叶病评价方法。具体操作为: 在春季气温回升至(20±2)℃，采集带有甘蔗花叶病的多品种混合病叶，用剪刀把叶片剪碎于研钵中，加接种用缓冲液[0.01 mol L–1PBS (pH=8.0) 1 000 mL，Na2SO31.0 g]和石英砂进行研磨，经过3~5 min研磨，双层纱布过滤榨汁，滤液即为带有病毒的接种物。采用涂抹接种法，对带有2~4片完全展开叶的甘蔗小苗进行接种，方法是：洒少量石英砂于甘蔗植株心叶基部，以拇指和食指在接种物中沾湿，在心叶外侧紧捏心叶基部，加压轻轻搓2~3次，至擦伤叶表皮，共接种4次，每次间隔6 d。在潮湿天气或阴天接种为佳，若是晴天，则在傍晚进行，且保持土壤湿润。待接种的甘蔗小苗应是无花叶或嵌纹症状。从发病开始统计感染株数，每隔15 d调查1次，直到发病基本稳定为止。试验于广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所)翁源甘蔗育种基地新陂村试验田进行。

分级标准 依据《NY/T 1786-2009 农作物品种鉴定规范, 甘蔗》[12]分级标准划分为5级，1级为具免疫性，发病率为0；2级为高抗性，发病率为1%~10%；3级为中抗性，发病率为10.1%~33%；4级为具感病性，发病率为33.1%~66%；4级为高感病性，发病率大于66.1%。

2 结果和分析

2.1 甘蔗与斑茅BC1真实杂种鉴定

经电泳检测(图1)，78份供试无性系均为甘蔗与斑茅杂交的真实杂种后代，其中YCE01系列55份：YCE01-3、YCE01-11、YCE01-13、YCE01-33、YCE01-34、YCE01-36、YCE01-42、YCE01-43、YCE01-45、YCE01-46、YCE01-48、YCE01-58、YCE01-59、YCE01-60、YCE01-61、YCE01-63、YCE01-64、YCE01-69、YCE01-71、YCE01-75、YCE01-80、YCE01-81、YCE01-85、YCE01-86、YCE01-87、YCE01-88、YCE01-89、YCE01-90、YCE01-92、YCE01-93、YCE01-94、YCE01-96、YCE01-97、YCE01-99、YCE01-101、YCE01-102、YCE01-103、YCE01-105、YCE01-106、YCE01-109、YCE01-112、YCE01-114、YCE01-115、YCE01-116、YCE01-118、YCE01-119、YCE01-120、YCE01-121、YCE01-123、YCE01-125、YCE01-126、YCE01-127、YCE01-129、YCE01-133和YCE01-134，YCE02系列23份：YCE02-4、YCE02-9、YCE02-16、YCE02- 20、YCE02-32、YCE02-52、YCE02-72、YCE02-82、YCE02-93、YCE02-96、YCE02-101、YCE02-105、YCE02-119、YCE02-122、YCE02-123、YCE02-164、YCE02-167、YCE02-179、YCE02-184、YCE02-185、YCE02-186、YCE02-193和YCE02-194。

2.2 抗黑穗病初步评价

从表1可见，对照种F134 (感小种2，抗小种1)的发病率为64.29%，NCo310 (抗小种2，感小种1)的发病率为36.04%，YC71-374 (高感小种1和2)的发病率为80.00%，在37份鉴定无性系中，表现出高抗(1级)的有6份无性系，占总数的16.21%, 分别为YCE01-48、YCE01-71、YCE01-105、YCE01- 125、YCE02-119和YCE02-184，1~3级抗性的共8份(21.62%)，高感无性系有12份(32.43%)。表现1级、3级、8级和9级抗性的无性系数量占总数的54.05%，表明参试的甘蔗与斑茅的BC1抗黑穗病表现出性状分离。

表1 参试甘蔗与斑茅BC1抗黑穗病表现

HR: 高抗; R: 抗病; MR: 中抗; MS: 中感; S: 感病; HS: 高感。下表同。

HR: High resistance; R: Resistance; MR: Middle resistance; MS: Middle sensitivity; S: Sensitivity; HS: High sensitivity. The same is following Table.

2.3 抗花叶病初步评价

从表2可见，对照种ROC22的发病率为49.64%, 62份鉴定无性系中，有20份表现出具免疫(1级, 占总数的32.26%)，15份表现出高抗(2级，24.19%)，15份表现出中抗(3级，24.19%)，1~3级抗病的无性系共有50份(80.65%)，这表明甘蔗与斑茅的BC1对花叶病害具有普遍的抗性，是甘蔗抗花叶病遗传改良的优异抗源种质资源。

3 结论和讨论

3.1 甘蔗与斑茅杂交后代分子鉴定

甘蔗杂交常受授粉方式影响，从而产生假杂种，因此真假杂种鉴别极其关键。甘蔗属间杂交后代鉴定曾采用同工酶方法，但邓海华等认为该方法可用于辨别真杂种而无法排除假杂种[14]，染色体鉴定方法，如Giemsa-C带分带[15]和荧光原位杂交[16]能有效鉴别杂交后代的真实性，但试验流程复杂, 成本高。而基于PCR检测的杂交后代分子鉴定具有特异性高、重复性好、操作简便等优点，更适合大规模群体鉴定。本试验采用斑茅特异性引物EF1/ ER1[11,17–18]，对甘蔗与斑茅BC1杂交后代进行检测，3次生物学重复检测结果一致，鉴定出的78份真实杂种后代为甘蔗斑茅杂交的利用提供了可靠的种质资源。

本研究参试无性系的斑茅原始亲本都为6倍体(2=60，=10)，基于斑茅基因组rDNA区域设计的PCR检测位点分布在6条染色体上[19–20]，特异性高，检测结果可靠。但随着甘蔗与斑茅的回交代数增加，斑茅染色体会逐渐丢失，至BC3无性系普遍只有5~8条斑茅染色体[5]，对BC4以后的无性系进行鉴定，该检测方法灵敏度降低，甚至失效。因此,开发斑茅染色体全覆盖的特异性引物分子鉴定体系，对于甘蔗斑茅种质资源高代无性系的创制和开发利用具有重要意义。

表2 甘蔗与斑茅BC1抗花叶病表现

I: 免疫。

I: Immunity.

3.2 甘蔗与斑茅杂交后代抗病性利用

甘蔗鞭黑粉菌()引起的甘蔗黑穗病是中国蔗区最严重的甘蔗病害之一，黑穗病抗性也成为品种选育的重要指标之一。沈万宽等对国内现有部分甘蔗品种(品系)进行抗性评价, 仅个别品种表现抗病[24–25]。本文从37份甘蔗与斑茅杂交BC1无性系中筛选出具1~3级抗性的8份品种(品系)(占21.62%)，与现有栽培种[24–25]相比，甘蔗与斑茅杂交BC1黑穗病抗性表现较好。本研究采用蔗区田间直接收集黑穗病混合孢子进行接种，使用感染不同生理小种的品种作为对照，F134 (感小种2，抗小种1)的发病率为64.29%，NCo310 (抗小种2，感小种1)为36.04%，YC71-374 (高感小种1和2)为80.00%，说明该试验蔗区优势病原菌为生理小种2。本试验对侵染源未进行生理小种的准确鉴定，不排除不同品种对不同病原小种存在感病差异，另有报道中国蔗区可能存在第3个黑穗病菌生理小种[26–27](目前未见其柯赫氏法则鉴定报道)，因此有关更加快速准确的抗性鉴定方法有待完善更新；其次，不同蔗区的黑穗病抗性鉴定结果[13,28]存在差异，不排除环境对甘蔗抗病性和病原侵染能力的影响，准确评价甘蔗抗病性还需要多年多点试验。

甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaicvirus, SCMV)、高粱花叶病毒(sorghum mosaic virus, SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(sugarcane streak mosaicvirus, SCSMV)为甘蔗花叶病病原物[29]，严重危害甘蔗产量和品质[30–31]。李文凤等在电镜下对云南省21份栽培种进行观测，结果表明样品均感染甘蔗花叶病, 并存在病原复合侵染[32]。Li等对我国33份斑茅野生种质资源进行SrMV抗性鉴定，33份斑茅无性系中有22份(66.7%)呈中抗至高抗[33]。本研究共有50份(占80.65%)呈1~3级抗性，表明甘蔗与斑茅的BC1可能成为甘蔗抗花叶病遗传改良的优良抗源亲本, 这与吴嘉云等[34]的研究结果相似。

目前，国内外对于甘蔗与斑茅杂交后代的病害抗性鉴定报道较少。本研究对甘蔗与斑茅杂交BC1采用人工接种花叶病毒和黑穗病菌，结果表明，甘蔗与斑茅杂交BC1对花叶病表现普遍抗性，对黑穗病抗性表现分离，其中YCE01-48、YCE01-71、YCE01- 105、YCE01-125、YCE02-184和YCE01-118无性系对两种病源均呈现抗性，可进一步鉴定和挖掘其作为抗性亲本的利用价值。

3.3 甘蔗与斑茅杂交BC1染色体遗传与抗病性

甘蔗染色体遗传构成复杂，甚至同一植株不同体细胞的染色体数目也可能存在差异[35]，且其配子存在单价体、二价体、三价体等[36]，Piperidis等通过GISH对甘蔗与斑茅杂交后代BC1无性系进行检测，结果表明BC1含斑茅染色体数为21~30，其染色体构成为2+[37]，2来自F1。吴嘉云的研究表明，12份BC1无性系的染色体数目为116~130条, 其中含有斑茅的数目为22~35条，而其母本，即甘蔗与斑茅杂交F1代含有斑茅染色体数目在28~30条，验证了BC1染色体构成为2+，且BC1染色体存在超2现象[5]。同时还观察到甘蔗与斑茅染色体发生易位，这进一步加剧甘蔗与斑茅杂交后代染色体组成复杂程度。本研究结果表明BC1黑穗病抗病性表现分离，这可能与BC1斑茅染色体的2及超2构成有关。

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Molecular Identification and Resistance Evaluation to Smut and Mosaic Disease with BC1of×

WU Xiao-bin, WANG Qin-nan, LING Qiu-ping, YANG Zhan-duan, CHEN Yong-sheng, HUANG Jun-jian, WU Jia-yun*, LI Qi-wei*

[Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangdong Provincial Bioengineering Institute (Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute), Guangzhou 510316, China]

In order to understand the utilization value of hybrids betweenandas resistant parents, the resistance to smut and SCMV of some progenies BC1from×were evaluated by artificial inoculation of pathogens. The results showed that most of BC1had the resistance to SCMV, and the resistance to smut was segregative among progenies. The BC1clones YCE01-48, YCE01-71, YCE01-105, YCE01-125, YCE02-184 and YCE01-118 showed co-resistance to smut and SCMV. So, they could be used as parents with high disease resistance for sugarcane breeding.

;;Molecular identification;Disease resistance

10.11926/jtsb.3926

2018-04-16

2018-07-08

国家自然科学基金项目(31571730, 31701488, 31401440)；广东省科技计划项目(2014A030304027, 2015A030302030, 2017A030303048)；广东省自然科学基金项目(2015A030313696, 2015A030310286)；国家糖料产业技术体系项目(CARS-170107)；广东省科学院专项资金(2017GDASCX-0105)资助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31571730, 31701488, 31401440), the Project for Science and Technology Planning in Guangdong (Grant No. 2014A030304027, 2015A030302030, 2017A030303048), the Natural Science Foundation in Guangdong (Grant No. 2015A030313696, 2015A030310286), the Project for National Sugar Industry Technical System of China (Grant No. CARS-170107), and the Special Projects of Guangdong Academy of Sciences (Grant No. 2017GDASCX-0105).

吴小斌(1990~ )，男，硕士，主要从事甘蔗病害、分子设计育种方面研究。E-mail: wuxiaobin@163.com

E-mail: jiayunng@163.com, liqiwei66@163.com