动脉粥样硬化相关miRNAs研究新进展

范翥元 刘丹 张广炜

内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院（内蒙古包头014010）

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，主要发生在大、中动脉的层流紊乱部位，尤其是动脉支点和分叉处［1］，是脑卒中的主要危险因素之一［2］。当各种理化因素使血管内皮受损后，血液中的低密度脂蛋白胆固醇渗入血管内皮下，导致血管内皮细胞黏附分子激活，调节单核细胞进入血管内皮下，分化成巨噬细胞，吞噬脂蛋白颗粒，形成泡沫细胞，导致动脉粥样硬化形成，同时，平滑肌细胞迁移至血管表面，分泌因子如人成纤维细胞生长因子β、肿瘤坏死因子α、表皮生长因子等则使平滑肌细胞转变为成纤维细胞表型，然后分泌各种纤维，在斑块表面形成纤维帽，纤维帽变薄、斑块内出血使斑块破裂［3］。随着科学技术的发展，可以越来越准确地识别出有破裂危险的易损斑块。因此，通过监测动脉粥样硬化斑块来检测易损斑块，对无症状、但是有脑卒中危险的斑块携带者，能够预防脑卒中的发生。目前已证实，miRNAs参与动脉粥样硬化相关的多个细胞和分子过程，并且发挥着重要作用［4-5］。

1 miRNAs与动脉粥样硬化的相关性

miRNA与动脉粥样硬化发病机制密切相关，主要参与调控颈动脉内膜中层厚度（intima-media thickness，IMT）、血流动力学、氧化应激、胆固醇代谢、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）、血管新生、炎性反应、泡沫细胞、稳定纤维帽等发生发展过程，现从以下几个方面进行概述。

1.1miRNAs的生物合成与作用机制miRNAs是一种内源性的、单链的、长度为18～25个核苷酸的非编码RNA，存在于线虫、果蝇、植物和包括人在内的真核生物中。miRNAs通过与mRNA的相互作用，参与调控约60%的哺乳动物蛋白编码基因的表达［6］。同时，miRNAs与稳定载体（包括微粒子和外泌体）相关，可能作为疾病的生物标记物或治疗靶点［7］。

利用RNA聚合酶Ⅱ，将细胞核内编码microRNA的基因转录成初级miRNA，再经Drosha/DGCR8微处理机复合物处理，形成具有茎环结构的前体microRNA；前体microRNA通过依赖于Ran-GTP的核质转运体Exportin5输出到细胞质中。在DIcerase、Ago蛋白家族和RNA结合蛋白TEBP的共同作用下，形成成熟的miRNAs，并与RNA诱导的沉默复合物（RISC）结合形成miR-RISC复合物，通过与靶mRNA的3′端非翻译区完全或不完全配对结合，可降解靶mRNA或抑制其翻译，进一步发挥调控作用［8-9］。

1.2miRNAs与颈动脉IMT动脉粥样硬化主要涉及大动脉和中动脉的内膜。首先，IMT变厚，内膜变粗糙并逐渐形成斑块，斑块伸入管腔并导致管腔狭窄。当颈动脉狭窄＞50%时，可能发生血流动力学变化，导致远端狭窄和低灌注。IMT增厚是早期评价动脉粥样硬化及脑血管病的指标［10］。

测量IMT厚度通常用于评估亚临床动脉粥样硬化形成或动脉粥样硬化的程度。HUANG等［11］使用实时荧光定量PCR检测血浆miR-29c水平，颈动脉超声检测IMT，通过Spearman相关系数和多元线性回归分析，评价miR-29c与IMT之间的相关性，研究表明IMT与miR-29c呈正相关，这项研究首次表明血浆miR-29c可以作为亚临床动脉粥样硬化的独立预测因子。但是动脉粥样硬化的发展是复杂的，一个重要的假设是动脉粥样硬化是由几种炎症细胞类型和（或）炎症反应的血管浸润引起的。C反应蛋白是1930年发现的一种急性期蛋白，是感染或炎症状态的早期重要指标。C反应蛋白也是颈动脉粥样硬化进展的重要标志物。同时，发现研究组血浆miR-29c和C反应蛋白水平高于对照组，CIMT与miR-29c、C反应蛋白呈正相关，miR-29c水平也与C反应蛋白呈正相关。证实miR-29c和C反应蛋白联合曲线下面积比单独使用miR-29c或C反应蛋白的曲线下面积更能反映临床前动脉粥样硬化，提示miR-29c联合C反应蛋白可能在动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用。此外，LIU等［12］使用ApoE/小鼠构建动脉粥样硬化模型，用超声生物显微镜检测IMT，研究血清miR-217水平及其与IMT的相关性，结果证明，ApoE/小鼠血清miR-217水平下降，与动脉IMT呈负相关，结合miR-217模拟治疗后血脂水平下降和IMT减低，进一步研究证实miR-217可以抑制动脉粥样硬化相关炎症因子的分泌和脂质沉积形成，可以推断miR-217具有抑制动脉粥样硬化斑块形成的能力，表明miR-217可能是一种潜在的新的治疗策略。

1.3miRNAs与动脉粥样硬化

1.3.1miRNAs与血流动力学暴露于不均匀环境下的动脉的分支和弯曲处，动脉粥样硬化斑块优先形成，血流紊乱模式的两种机制为对机械刺激的质量输运和血管反应的改变，可以解释血流紊乱和动脉粥样硬化发展之间的联系。质量运输理论认为，某些生物活性物质，可能在血液中，与血管内皮细胞长期接触，导致在血流紊乱的部位得到促进。剪切应力理论强调血流诱导的机械力对血管生理的影响。上述两种机制都会影响斑块的形成，并在功能层面相互作用［13］。

LEE等［14］采用大鼠和载脂蛋白E缺乏小鼠模型，进行体外和体内实验，通过靶向GATA6，下调促炎信号通路GATA6/VCAM-1，抗动脉粥样硬化保护脉冲剪切应力诱发RARα/RXRα异质二聚体的形成，提高miR-10a转录；相反，促动脉粥样硬化振荡剪切应力诱发HDAC-3/5/7 RARα阻遏杂合物的形成，抑制miR-10a的表达，从而在内皮细胞中上调GATA6/VCAM-1信号。研究表明miR-10a可能成为动脉粥样硬化的诊断分子。研究结果还表明，通过给予RARa/RARα特异性激动剂在体内诱导内皮细胞miR-10a。研究发现提供了新的机制，调节病变发展的血管壁，从而干扰血液流动，可能提供一种基于血流动力学的动脉粥样硬化治疗策略。

1.3.2miRNAs与胆固醇代谢动脉壁的脂质积累，是动脉粥样硬化形成的第一步。脂质代谢的改变增加脑部代谢紊乱的风险。对于脂质代谢紊乱，药物治疗仍然是降低脑血管病发生率的最常用措施。miRNAs参与脂质代谢，主要作用于转录后水平。新的证据表明，miRNAs是脂质和脂蛋白代谢的关键调控因子，可能是动脉粥样硬化的治疗靶点［15-16］。

以往研究证实miR-33a和miR-33b参与调控HDL-C代谢与胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）的过程。NGUYEN 等［17］研究出壳聚糖纳米颗粒，称为chNPs，用于向巨噬细胞传递功能miRNA模拟物，研究发现chNPs可以保护和转移外源性miR-33到幼稚巨噬细胞，并改变其靶基因腺苷三磷酸结合盒转运体A1基因（ATP-Binding Cassette Transporter 1 gene，ABCA1）在体内和体外的表达。此外，证实用含有miR-33的chNPs处理的巨噬细胞向apoA1的胆固醇外排减少，而用这些纳米颗粒处理的小鼠的RCT也下降。研究结果表明，miRNAs可以通过纳米颗粒高效地传递到巨噬细胞，在那里它们可以逃脱内溶酶原降解，并能够调节ABCA1表达和胆固醇外排。这可能应用于其他基于miRNA的治疗，特别是在心脑血管和炎症性疾病中，并可能使基于RNA治疗这些疾病。另外，RAMIREZ等［18］发现，ABCA1是miR-144的直接作用靶点，抑制miR-144可以增加肝细胞和巨噬细胞中ABCA1的表达，并提高小鼠血浆HDL水平。许多miRNAs，包括miR-33、miR-122和miR-148a，已经被证明通过调节胆固醇稳态和脂蛋白代谢在控制急性脑血管病风险方面发挥重要作用［19］。WEZE等［20］观察到通过抑制miR-494、HDL进入肝脏，可减少病灶的坏死核大小及增加胶原含量，可以将血管壁多余的胆固醇清除，减少动脉粥样硬化的发生。之前有研究表明，趋化因子受体4/趋化因子受体12在动脉粥样硬化中起保护作用，抑制miR-494导致内皮细胞和平滑肌细胞中趋化因子受体4显著上调，其配体趋化因子受体12在巨噬细胞和肥大细胞中显著升高，并导致巨噬细胞人激活素A受体I和金属蛋白酶组织抑制因子的上调。miR-494成为动脉硬化新的治疗靶点。

1.3.3miRNAs与氧化应激氧化应激是动脉粥样硬化的主要特征之一。动脉粥样硬化危险因素与过量活性氧生成和低密度脂蛋白氧化有关。作用于细胞类型的氧化型低密度脂蛋白促进动脉粥样硬化形成。针对过量活性氧生成、抗氧化系统、抑制氧化低密度脂蛋白的形成以及阻断其受体的治疗策略可预防氧化应激和改善动脉粥样硬化［21］。

LIN等［22］研究靶向Nrf2和Sirt2的miR-140-5p，影响动脉粥样硬化患者的高血压和氧化应激的分子机制。研究发现miR-140-5p作为一种优秀的抗氧化剂，诱导Sirt2/Nrf2/HO-1信号通路抑制动脉粥样硬化中的氧化应激。因此，研究结果表明miR-140-5p/Sirt2/Nrf2在动脉粥样硬化的防治中具有重要作用。GOU等［23］研究发现miR-92a在糖尿病ECs中的表达升高。miR-92a过表达损害内皮功能，抑制内皮细胞HO-1表达。抑制miR-92a通过增强HO-1在db/db小鼠主动脉中的表达和活性，能够减轻氧化应激并改善内皮功能。LIU等［24］研究miR-181a在氧化应激诱导的内皮细胞功能障碍中的作用。研究报道miR-181a在人类动脉粥样硬化斑块中较正常血管上调。miR-181a是由H2O2处理诱导的。外源性过表达miR-181a可加速H2O2作用下HUVECs的凋亡率。研究确定Bcl-2是miR-181a的直接靶点。此外，还观察到H2O2处理抑制了Bcl-2在蛋白和mRNA水平的表达。抑制miR-181a可以恢复Bcl-2的表达，导致对H2O2的耐药性增加。此外，miR-181a过表达，HUVECs中Bcl-2的恢复使细胞耐受更高浓度的H2O2。最后，miR-181a与Bcl-2在人动脉粥样硬化斑块中的表达呈负相关关系。研究结果证实miR-181a在动脉粥样硬化形成过程中通过调节内皮功能障碍，给用于开发新的抗氧化药物及动脉粥样硬化的治疗提供机制。

1.3.4miRNAs与VSMCVSMC的增殖在动脉粥样硬化中起着重要作用，在动脉粥样硬化的病理过程的开始，不规则的VSMC增殖促进斑块的形成。最近的研究表明，miRNAs在血管系统中表达，参与VSMC增殖的调控［25］。

ZHANG等［26］在体内构建大鼠血管损伤模型，然后，用miRNA芯片分析miRNA的表达谱，观察到miR-451在损伤颈动脉中显著下调，尤其是miR-451的上调在体内显著抑制颈动脉结扎诱导的内膜增生，在体外抑制血小板衍生生长因子型BB（platelet-derived growth factor type BB，PDGF-BB）诱导的VSMCs增殖和迁移。重要的是，研究证实miR-451可以通过靶向Ywhaz阻断p38 MAPK信号通路，从而抑制PDGF-BB处理的VSMCs的增殖和迁移。在此基础上，miR-451可能成为动脉粥样硬化内膜增生的潜在治疗靶点。此外，LIU等［27］研究了miR-133b在体外对动脉粥样硬化血管平滑肌细胞的影响，发现miR-133b在动脉粥样硬化家兔血液和动脉粥样硬化斑块组织中显著降低，并且使用TargetScan和双荧光素酶报告基因分析miR-133b的靶基因，证明了基质金属蛋白酶9是miR-133b的直接靶基因，结果表明rVSMCs中miR-133b的表达与基质金属蛋白酶9呈负相关。研究数据显示，与对照组相比，miR-133b模拟物能够显著抑制rVSMC细胞增殖活性、迁移能力，诱导细胞凋亡，而这些作用均被基质金属蛋白酶9质粒逆转，这些发现强调了miR-133b/基质金属蛋白酶9轴在动脉粥样硬化中的重要作用。miR-133b可能是动脉粥样硬化的一个有价值的临床标志物和治疗靶点。LI等［28］发现，在PDGF刺激后，miR-320在人VSMCs中的表达在时间和剂量上显著下调。功能分析表明，miR-320可以抑制VSMCs在基础和PDGF刺激条件下的增殖和迁移。此外，在荧光素酶报告基因检测中，npilin 1（NRP1）被证明是miR-320的直接靶点，无论是否经过PDGF处理，miR-320过表达均可抑制NRP1的表达。最后，结扎损伤后小鼠颈动脉中miR-320表达明显下降，而AdmiR-320通过降低NRP1表达，使新生内膜增生减弱，而恢复miR-320。结果证实miR-320通过靶向NRP1调控VSMCs的增殖、迁移和新生内膜的形成。这些新发现提示miR-320调控NRP1表达在增殖血管疾病的早期诊断和治疗中具有重要意义。因此，研究miRNAs对VSMC和内皮细胞增殖的影响具有重要意义。

1.3.5miRNAs与血管新生血管生成是动脉粥样硬化斑块破裂发生发展过程中的重要因素，局部新生血管形成与斑块稳定性密切相关［29］。

CHEN 等［30］评估 miRNA-21在血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）介导的人微血管内皮细胞（human microvascular endothelial cells，HMECs）促血管生成反应中的功能参与。研究发现AngⅡ在HMECs中具有促血管生成的作用，表现为促进增殖、迁移和成管。其次，miRNA-21在AngⅡ治疗的HMECs中表达上调，其特异性抑制剂有效地阻断了AngII的促血管生成作用。随后，重点研究了信号转导与转录激活因子（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在AngⅡ介导的血管生成过程中的本构性激活。生物信息学分析表明，STAT3是启动miRNA-21表达的转录因子，并经ChIP PCR验证。一个基因报告实验进一步确定了miRNA-21启动子区域中STAT3的3个功能结合位点。此外，磷酸酶和紧张素同源物（phosphatase and tensin homologues，PTEN）被认为是miRNA-21的靶点，抑制STAT3可以恢复AngⅡ诱导的PTEN的减少。同样，STAT3/miRNA-21轴在体内介导AngⅡ引起的血管生成，这是通过使用适当的抑制剂来证明的。研究表明STAT3/miRNA-21通路参与了AngⅡ诱导的HMECs新生血管萌发。进一步证实，在暴露于AngⅡ的HMECs中，STAT3通过诱导miRNA-21介导抑制PTEN，是连接血管生成和动脉粥样硬化的表观遗传开关的一部分。研究发现以STAT3miRNA-21轴为靶点，结合现有的常规治疗策略，可作为动脉粥样硬化的有效治疗手段。LIANG等［31］探讨缺氧诱导内皮细胞细胞膜微粒（endothelial microparticles，EMPs）中 miRNA-19b的变化及其对内皮细胞的影响，研究证实miRNA-19b在缺氧诱导的EMPs中是存在的，并且可以从EMPs转移到人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中。研究发现，在miRNA-19b上的人转化生长因子β2（human converted growth factor beta 2，TGFβ2）转录活动的抑制作用，荧光素酶检测TGFβ2是miRNA-19b靶基因，通过下调TGFβ2表达，来减少HUVEC迁移和血管生成。这项研究表明EMPs中的miR-19b可能是进一步研究动脉粥样硬化的新靶点。QUN等［32］研究miRNA-27b在动脉粥样硬化环境下内皮细胞血管生成活性中的作用，在动脉粥样硬化斑块中，发现miRNA-27b的表达显著增加，进一步鉴定其靶基因为Tubedown-1（Tbdn-1，Naa15），研究证实，通过调控调控内皮细胞miRNA-27b的表达，可能是一种的治疗动脉粥样硬化的方法。MIAIMAITI等［33］发现，miR-106b通过STAT3参与的信号通路，直接作用于STAT3位点，在内皮细胞中发挥抗血管生成作用。

1.3.6miRNAs与炎性反应动脉粥样硬化是一种慢性炎症，炎性反应的关键成分之一是巨噬细胞，巨噬细胞分泌促炎性因子导致斑块破裂，巨噬细胞的极化受各种微环境刺激分为M1、M2型，影响动脉粥样硬化的易感性。考虑到M1促炎、M2抗炎巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块中的不同特性，发现能够逆转巨噬细胞M2表型分化，对预防脑卒中事件十分重要。

AN等［34］发现，miR-181b参与调节免疫细胞分化，在单个核细胞中高表达，在大脑缺血后降低，并参与动脉粥样硬化斑块的形成。并且Notch1信号的异常激活与巨噬细胞功能失调有关，miR-181b通过直接靶向Notch1调控巨噬细胞极化，从而调控动脉粥样硬化斑块的易损性。SU等［35］研究发现，在动脉粥样硬化斑块中，miR-181a-5p和miR-181a-3p的表达均下降，并且能够缓解血管炎症和细胞募集，阻断HUVECs中的NF-κB传导信号通路。研究首次证明miR-181a-5p及其传递链miR-181a-3p是抗动脉粥样硬化的miRNA，通过靶向TAB2和NEMO来延缓动脉粥样硬化的进展。因此，miR-181a-5p和miR-181a-3p的修复可能是治疗动脉粥样硬化的一种新的治疗方法。DU等［36］研究发现miR-135a可以通过调节RAW264.7细胞中的TLR4信号通路，使miR-135a过表达从而抑制细胞炎症和氧化应激，并验证了二者之间的负相关关系。研究证实，miR-135a可以通过体外抑制TLR4信号通路抑制动脉粥样硬化的发生发展。

1.3.7miRNAs与泡沫细胞在动脉粥样硬化发展过程中，巨噬细胞通过吞噬大量的脂质而形成泡沫细胞，构成了斑块内的脂质核心，同时，可以分泌大量的细胞因子、趋化因子和蛋白酶和其他炎症介质，促进斑块局部炎性反应，减少斑块稳定性，导致斑块破裂，从而导致急性脑血管病的发生。

ZHANG等［37］研究miR-155通过调控巨噬细胞中胆固醇酯酶的表达，改变巨噬细胞向泡沫细胞转化的潜在机制。结果发现miR-155模拟物导致巨噬细胞中胆固醇酯酶在转录和翻译水平上均表达增加，可以有效抑制泡沫细胞的形成，减少细胞内脂质的积累。结果证实通过抑制Tim-3的表达，使得miR-155的这一作用显著降低。因此，miR-155可能是治疗动脉粥样硬化的一个新的治疗靶点。YANG等［7］发现，miR-23a-5p是泡沫细胞形成相关的miRNA，直接抑制ABCA1和ABCG1的表达，抑制胆固醇的外排促进泡沫细胞的形成，增加斑块易损性。所以ABCA1/ABCG1依赖性通路和miR-23a-5p可能是抑制动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。此外，DAI等［38］发现miR-98表达降低可能与载脂蛋白e/-小鼠主动脉中LOX-1表达、泡沫细胞形成和脂质积累有关。血浆miR-98水平可能是动脉粥样硬化疾病过程的生物标志物，其调控可能为动脉粥样硬化提供治疗策略。

1.3.8miRNAs与稳定纤维帽稳定纤维帽，防止动脉粥样硬化斑块破裂，可能是一种降低脑血管发病率和死亡率的方法。EKEN等［3］利用局部采集的、血浆中的纤维帽组织，发现miR-210是纤维组织合成、并释放到局部组织环境中主要的miRNAs。miR-210在不稳定斑块的纤维帽中显著下调，抑制Wnt信号转导的抑癌基因APC（腺瘤息肉大肠杆菌）的表达。miR-210-APC-Wnt信号轴在动脉粥样硬化中的作用表明，miR-210模拟物特异性可以稳定斑块，减少脑卒中的发生。

2 miRNAs展望

miRNAs通过与多种因子的靶mRNA结合，上调或下调动脉粥样硬化相关基因的表达，调控细胞内多种信号通路的转导，进而参与颈动脉内膜中层厚度、血流动力学、氧化应激、胆固醇代谢、血管平滑肌、血管新生、炎性反应、泡沫细胞、稳定纤维帽等过程的调节。近些年的研究发现miRNAs在不同类型的细胞中，可能表现出不同的作用，而且，相同的miRNA在动脉粥样硬化的不同时期表现出不同的作用。最新研究证实，临床试验中miRNAs的进一步发展和miRNAs递送方法的改进，可能会促进在动脉粥样硬化背景下细胞特异性miRNAs治疗的发展。总之，对miRNAs在动脉粥样硬化发病机制中作用的深入研究，有助于为人类脑血管疾病的预测及治疗提供新思路。