种植材料表面纳米级形貌对细胞成骨效应的影响

蔡彦坤 祁星颖 综述 隋磊 审校

材料表面的形态特征是影响种植体骨整合效果的重要因素，适当粗糙表面较之光滑表面更有利于骨整合的形成［1］。目前应用于临床的种植体表面多具有微米级形貌，有利于细胞成骨向分化，但可能抑制成骨细胞增殖，影响种植体表面成骨速度［2］。纳米级形貌是指至少在一个维度上尺寸为纳米级水平的显微形貌。采用酸蚀［3］、阳极氧化［4-6］、碱热、水热［7］、电子束刻蚀［8］等方法可在材料表面获得具有不同几何形态的纳米级形貌，常见者包括纳米管［9-10］、纳米结节［11］、纳米球［12］、纳米凹坑［13］、纳米沟槽［14］等。这些纳米级形貌或单独存在，或与微米级形貌形成复合结构，都会对组织细胞的生物学行为产生一定影响，多数学者认为其对材料表面成骨具有促进作用［1，15-16］。

本文综述种植材料表面纳米级形貌对细胞成骨效应的影响及其机制，以期为相关实验研究及后期临床转化提供线索。

1 细胞黏附

一般认为，纳米级形貌对细胞成骨效应的影响机制在于其对早期蛋白吸附、细胞粘附及后续的细胞伸展、增殖、分化等一系列生物学行为的调控。其中，整合素介导的细胞粘附是纳米级形貌产生作用的最重要环节。整合素是由α和β亚单位链构成的跨膜受体，直径约为8～12 nm，其细胞内部分通过多种衔接蛋白（talin，vinculin，paxillin等）与肌动蛋白丝相连，并通过肌动蛋白丝与细胞核实现连接［17-18］。当细胞与具有纳米级结构的材料表面接触时，细胞外基质首先与材料表面发生反应，其中的蛋白质通过静电引力吸附于纳米结构表面［19］，这些蛋白质的RGD序列（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列）作为配体，可以与整合素发生特异性结合［17］。细胞的丝状伪足表面含有整合素，在丝状伪足伸出并感知细胞所处环境、收集空间信息的过程中，其上的整合素与吸附于纳米级形貌表面的RGD蛋白相结合，形成包含RGD蛋白、整合素、衔接蛋白以及肌动蛋白丝在内的超分子复合体，即黏着斑（focal adhesion，FA）。黏着斑的形成使细胞伪足锚定在粘附位点上。当黏着斑数量较多且间距适宜时，在肌动蛋白丝的牵引下相互连结聚合，形成更大更成熟的黏着斑复合物（直径约为2～5μm）［18］，促进细胞的粘附。研究表明，单个RGD配体间距约70 nm时，有利于整合素受体与配体结合并聚集［20-21］，即有利于黏着斑复合物形成。黏着斑聚合的同时，肌动蛋白丝亦聚合成束，促使细胞骨架重组，为细胞在材料表面的伸展提供动力基础。在整合素-RGD蛋白发生结合的同时，整合素构象发生改变，会激活与之连接的黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）。FAK是一种酪氨酸激酶，在胞浆内通过整合素衔接蛋白与黏着斑共存，并与多种信号蛋白、结构蛋白相关联。当整合素构象因纳米及形貌的作用而发生改变时，与其相连的FAK上某些位点（如Tyr397位点）会发生自动磷酸化，并与Src蛋白结合形成FAK-Src复合物，进而发生一系列级联反应激活下游信号通路。FAK的激活可调控Rac1表达升高，有利于细胞板状伪足的形成，进而促进细胞在材料表面的锚定；同时还可激活Rho-GTPase（主要为RhoA），使肌球蛋白收缩，促进肌动蛋白聚合，为细胞伸展提供有利条件［22］。

2 细胞增殖

当细胞粘附在纳米级形貌表面后，即开始增殖活动。纳米级形貌对细胞增殖能力的促进可能与其表面吸附的蛋白、FAK信号通路及细胞间相互作用有关。①吸附蛋白：细胞通过表面吸附蛋白的介导粘附于材料表面，实验表明，细胞增殖能力与吸附蛋白的数量呈正相关［7］。此外，吸附于纳米结构表面的蛋白可能因纳米级形貌的不同而改变蛋白构象，继而影响整合素的结合及不同亚基的激活，从而调控细胞增殖［23］；②FAK相关信号通路：FAK的激活是细胞粘附后调控细胞增殖、分化的重要环节［24］，一方面，FAK的激活对其下游信号通路RhoA-ROCK的表达具有正向调控作用，从而促进细胞增殖［25］；另一方面，FAK-Src形成复合物后产生SH2结构域，与接头蛋白结合，再与Ras中的交换因子结合，从而激活Ras-Raf-MAPK／ERK通路，经过磷酸化级联反应将表面形貌信号转导至细胞核内，通过促分裂原蛋白活化激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的作用促进细胞分裂增殖［26-27］；③细胞间相互作用：细胞间相互作用时的信号传递主要由跨膜结构神经钙黏素（N-cadherin）完成，其对细胞增殖具有重要作用。在具有纳米结构的表面上，形状伸展的细胞较在光滑表面上类圆形的细胞需要更多的N-cadherin生成来维持细胞间的粘附，因而N-cadherin呈现高表达［28］。而N-cadherin能激活Ca2+通道，使与之相连的钙调素（calmodulin，CaM）激活，进而激活MAPK通路。

3 细胞分化

纳米级形貌对干细胞成骨向分化的调控机制目前尚不完全清楚。现有研究报道因所采用的纳米级形貌的形态不同、细胞分化水平不同以及所观察的信号通路不同，导致结论存在很多争议。一般认为，纳米结构对细胞成骨向分化的促进作用主要通过细胞骨架对机械力的传导以及整合素相关信号转导两方面实现。

细胞骨架对机械力的传导是目前本领域的研究热点之一。当细胞粘附于纳米级粗糙表面时，较之在光滑表面上具有更伸展的形态，细胞内部相应产生一定的张力，继而细胞骨架发生重组，以维持其形态的稳定。在此过程中细胞内产生了一系列机械信号和生物化学信号变化，主要包括：①细胞核形状变化：细胞骨架通过整合素与细胞外基质相连，连接细胞膜与核膜，又通过LINC复合体（linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton complexes）与细胞核骨架（nucleoskeleton）相连，使细胞作为一个整体感受外界机械力的变化。细胞骨架重组、张力增加，使细胞核的形状发生改变，细胞核骨架亦发生重组，进而在染色质重组酶的介导下使染色质重组［29］，染色质重组过程中，某些转录因子被激活，进而上调了成骨向分化相关基因的表达；②与细胞骨架相连的细胞因子被激活：细胞形态对YAP（yes-associated protein）等与细胞骨架相连的细胞因子在细胞质及细胞核内的分布有直接影响，有研究表明，细胞骨架的收缩和重组会抑制YAP在细胞质中的磷酸化，有利于YAP从细胞质转移至细胞核内。其入核后与RunX2等成骨分化相关转录因子结合，可促进细胞成骨向分化［30］；③钙离子通道：细胞内张力增加可能直接使牵张激活性Ca2+通道开放，Ca2+流入细胞内，激活CaM，CaM不仅可以激活MAPK通路，还可以与β连环素（β-catenin）结合，使肌动蛋白收缩，细胞骨架重组［31］，进而激活前述信号通路。

整合素相关信号转导是纳米级形貌调控细胞成骨向分化的另一重要机制。信号转导的起始环节主要包括FAK和整合素连接激酶（integrin linked kinase，ILK）的激活。①FAK的激活：FAK磷酸化可激活相关下游信号通路，如RhoA-ROCK通路［32］、MAPK通路等，促进成骨细胞相关基因ALP、RunX2、OCN、OPN等的表达，从而促进细胞的成骨向分化；②ILK的激活：ILK与整合素β亚基的细胞内部分相连。在纳米级形貌表面，整合素-RGD蛋白结合会改变整合素的构型，使 β1亚基选择性激活并高表达［3，33-34］，进而激活ILK，而被激活的ILK可抑制GSK-3β的表达及GSK-3β对β-catenin的磷酸化，使细胞质中游离的β-catenin不被降解，且逐渐在细胞质中积聚进而转移至细胞核中与RunX2等转录因子结合并表达［35］，促进细胞成骨向分化［28，34］。

综上所述，细胞对纳米级粗糙表面的粘附是纳米级形貌发挥促进细胞成骨效应的关键环节，其对细胞增殖、分化的影响均与整合素介导的细胞粘附及伸展密切相关，当材料表面的微观形貌利于整合素的聚集时，则有利于细胞的粘附，并为后续的细胞增殖、成骨向分化、细胞外基质矿化及骨组织成熟奠定良好基础；反之则细胞成骨效应不佳。因此可以认为细胞粘附是种植材料表面骨形成的前提和基础。然而，因不同实验间纳米级形貌特征、细胞种类及评价标准的差异，现有研究结果可比性尚存疑问。未来研究可采用激光处理等手段获得精确可控的纳米级表面形貌，排除混杂因素，更精准地了解特定纳米级形貌对细胞城固效应的影响及其机制，以期筛选出有利于成骨的最佳微观形貌，推动种植体体表面设计的更新迭代。