富亮氨酸α-2糖蛋白-1的研究进展

于菁 张俊

内蒙古医科大学附属医院1血液科，2放疗科（呼和浩特010050）

免疫炎症性疾病及肿瘤的发病率逐年上升，它们始终是医疗工作的难点及热点。越来越多的研究发现富亮氨酸α-2 糖蛋白-1（leucine-rich-alpha-2-glycoprotein-1，LRG1）在多种疾病的发生发展中起着重要的作用，其中在自身免疫性疾病、炎症性疾病标本中均可检测到LRG1 表达［1-5］，甚至在某些肿瘤患者的血液中科检测出LRG1 表达，并且具有相对稳定的特异性及灵敏度［6-10］。LRG1 可以作为炎症性疾病及某些肿瘤的新型生物学标记，对疾病的诊断及疾病预后有着非常重要的研究价值，而LRG1 主要通过转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路参与免疫炎症性疾病及肿瘤的发生发展得到了越来越多的研究者的关注并取得了重要的进展。本文就LRG1 通过调节TGF-β通路参与炎症及肿瘤的发生发展作一综述。

1 LRG1的结构及功能

人类富含亮氨酸的α-2-糖蛋白（leucine-richalpha-2-glycoprotein，LRG）的基因定位在19 号染色体短臂13 区3 带（19p13.3），其编码的LRG 是一种富含亮氨酸的α-2-糖蛋白，简称富亮氨酸糖蛋白，由HAUPT 等［11］从人的血清中分离出来，其氨基酸序列于1985年被确定［12］，该蛋白中的312 个氨基酸残基中包含66 个亮氨酸残基。LRG1 为富含亮氨酸重复序列家族中最早发现的成员，其分子质量为45 kDa，等电位点4.52 ～4.72。LRG1 共包含8 个富亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat，LRR），每个LRR 长度多为20 ～30 个氨基酸残基，其首要功能是在蛋白质的相互作用中提供一个多用的结构框架［13］。

2 LRG1 与TGF-β通路的关系

转化生长因子超家族包括转化生长因子-βs（TGF-βs）、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs）、活性蛋白、抑制蛋白等，哺乳动物体内TGF-βs 主要包含TGFβ1、TGFβ2 及TGFβ3 三个亚型，其中TGFβ1 发挥绝大多数的生物学效应，作为参与体内生理生化、信号转导与调控的重要因子，在免疫炎症性疾病及恶性肿瘤中的发生发展等起着重要的作用，TGFβ1 主要通过与Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β配体（TGFβRⅠ，TGFβRⅡ）结合实现对下游信号通路的调节［14-15］。研究发现TGF-β与TGFβRⅡ结合后招募并激活TGFβRⅠ，TGFβRⅠ调控下游Smads 蛋白使其C 末端丝氨酸残基磷酸化进而形成复合物易位进入细胞核通过转录调控目标基因。此外，TGF-β在非依赖Smad信号通路中可以通过激活某些激酶如有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPKs）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、肿瘤坏死因子相关受体因子4/6（TRAF4/6）和Rho 家族的鸟苷三磷酸酶传输信号进而参与炎症性疾病及自身免疫性疾病的发生发展，促进肿瘤血管生成及肿瘤细胞的转移［16-17］。

而近年来越来越多的研究发现LRG1 蛋白可以通过促进TGF-β信号通路进而通过依赖Smads和非依赖Smads 途径影响TGF-β下游生物学效应来参与如血管生成、炎症介质表达及释放、肿瘤细胞凋亡、上皮细胞间质细胞化等病理过程，进而促进了肿瘤、神经退行性疾病、自身免疫性疾病、炎症等的发生发展［18］。TGF-β1 与TGFβRⅡ结合后募集ALK 家族受体形成TGFβRⅡ/ALK 复合体激活Smads 蛋白促进内皮细胞有丝分裂并促进血管生成的作用，而该过程中辅助性受体内皮素在LRG1 影响TGF-β1 通路中有着重要作用：（1）辅助性受体内皮素存在的情况下LRG1 与TGFβRⅡ/ALK1 形成LRG1-ALK1-TGFβRⅡ-ENG 复合物，该复合物会激活下游Smad1/5/8 通路，发挥促进内皮细胞的迁移及血管生成的作用；（2）如果缺少辅助性受体内皮素的介导，LRG1 会与TGFβRⅡ/ALK5结合形成复合体，即LRG1-ALK5-TGFβRⅡ，该复合物会激活下游Smad2/3 通路，促进细胞外基质沉积，调节辅助T 细胞的分化，促进体内重要炎症介质白介素6 受体（interleukin-6 receptor，IL-6R）表达［19］促使内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表达增加［18］。因此，从这些研究中可以得出LRG1 通过TGF-β通路实现参与多种疾病的发生，其中最重要的是肿瘤及炎症性两大类疾病的发生发展。

3 LRG1 通过TGF-β通路参与炎症性疾病的发生发展

3.1 LRG1 通过TGF-β通路与关节炎症LRG1可通过调节TGF-β-Smad2 信号通路及非依赖Smads 途径来调节辅助T 细胞的分化进而参与骨关节及类风湿关节炎的发生发展［20］。首先，在胶原诱导型关节炎研究中发现LRG1 可能通过TGFβ-Smad2 信号通路促进Smad2的磷酸化影响免疫内稳态的CD4+T 细胞的分化分化方向：（1）LRG1促进TGF-β-Smad2 磷酸化诱导CD4+T 细胞Foxp3的表达，促进CD4+T 细胞向Treg 细胞的分化并通过干扰Th17 细胞的关键转录因子RORγt 达到抑制CD4+T 细胞向Th17 细胞分化；（2）白介素6（interleukin-6，IL-6）在调节性T 细胞（regulatory cells，Treg）分化中起重要作用，IL-6 可能对CD4+T 细胞的初始启动尤为重要，参与CD4+T 细胞的存活促进向Treg 细胞分化。Smad2 可能会根据IL-6的存在与否，引导CD4+T 细胞向Treg 细胞或Th17 细胞方向分化，其可以通过促进CD4+T 细胞重要炎症受体IL-6R 表达及重要炎症因子IL-6 释放进而促进向Treg 细胞分化抑制CD4+T 向Th17 细胞分化导致Th17 细胞和Treg 细胞比例的失衡。而Th17细胞和Treg 细胞比例失衡在的胶原诱导型关节炎发病机制中起着重要作用。其次，发现LRG1 可以通过促进TGF-β非依赖Smads 途径如p38 丝分裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）的磷酸化促进Th17细胞产生的白介素17（interleukin-17，IL-17）诱导中性粒细胞趋化促进关节炎症的发生［19］。研究［21］发现在类风湿关节炎患者血清LRG1 水平与健康组相比显著升高，并具有预测类风湿活动的作用，LRG1 可以反映了类风湿性关节炎的严重程度。

3.2 LRG1 通过TGF-β通路与代谢性疾病而KUMAGAI 等［22］在心衰和心梗后心肌重塑的相关研究中发现梗死后的心肌中LRG1的mRNA 和蛋白质的表达均上调，而在急性期LRG1 表达在24 h之内达到峰值，并与B 型-脑钠肽相关具有很好的预测心衰的潜能，在随后的心肌重塑中，LRG1 也通过TGF-β-smad1/5/8 信号通路增加血管生成和微血管密度，在心肌梗死后的亚急性期促进心肌重塑。同样，SONG 等［23］发现LRG1的高表达通过LRG1-ALK1-TGFβRⅡ激活Smad 1/5/8，从而增加了内皮细胞的迁移和血管管腔的形成，参与心室重构，促进心衰发生发展，而通过基因敲除、siRNA干扰或中和抗体抑制的LRG1的表达可抑制上述病理过程的发生发展。在血管性事件的发生中SHARON 等的研究发现LRG1 升高是预测动脉硬化、内皮功能障碍和外周动脉疾病的重要因子，研究表明在正常的血管稳态中，内皮细胞中的TGFβ信号通路通过TGFβRⅡ-ALK5-Smad2/3 信号通路发挥作用，内皮素通过TGFβRⅡ-ALK5-Smad2/3 信号通路来调控eNOS 合成，内皮素上调了Smad2 蛋白水平的表达，并增强了TGF-β信号通路，而导致eNOS 表达增加，后者在舒张血管中有重要作用，它的缺失或表达减少可导致心血管性疾病的发生。同时SANTIBANEZ 等［24］推测LRG1 及其与内皮素的结合作用如果被抑制而影响TGFβRⅡ-ALK5-Smad2/3 信号通路，可能会降低一氧化氮的生物利用度和内皮依赖性舒张功能，导致动脉硬化、内皮功能障碍和外周动脉性疾病。TOPORSIAN 等［25］研究中也表明，内皮素表达的相关基因敲除后阻力动脉显示出明显的eNOS 依赖性损伤。因此，LRG1 与血管活性物质如内皮素，一氧化氮的机制仍需进一步前瞻性研究，才能明确在血管疾病如何修改LRG1 表达实现治疗目的［26］。LRG1 与糖尿病多种血管并发症关系密切［27］，高血糖导致的代谢紊乱产生的慢性低度炎性反应参与糖尿病肾病的发生发展，研究发现LRG1 作为PPARβ/δ 下游，通过调节成纤维细胞的纤维化表型参与糖尿病肾脏疾病的发生［28-29］，此外糖尿病肾病中LRG1 被认为是一种危险因素，通过直接与TGF-β 配体内皮素结合，激活并增强促血管生成的Smad1/5/8 信号通路，引起肾小球毛细血管网内皮细胞的丧失及局部缺氧，促进内皮细胞增殖和迁移、病理性血管生成及肾小球基底膜增厚，导致肾脏有效率过率降低、尿蛋白和滤过障碍，促进糖尿病肾病的进展［30-32］。

3.3 LRG1 通过TGF-β通路与呼吸系统炎症LRG1 通过调节TGF-β通路同样在呼吸系统炎症性疾病发生发展中发挥着重要的作用，血浆中性粒细胞，嗜碱性粒细胞、辅助T 细胞、细胞毒性T 细胞、单核细胞和B 细胞等炎症细胞在炎症疾病发生过程中均可表达产生LRG1，其中肥大细胞是产生LRG1 最主要的细胞，在过敏反应中肥大细胞也是主要致敏细胞，通过脱颗粒等作用产生过敏反应。研究发现LRG1 与TGFβRⅡ在过敏性鼻炎和哮喘疾病过程中存在共表达现象，TGFβRⅡ作为LRG1的潜在细胞表面受体参与过敏性鼻炎和哮喘疾病的发生发展［33］。HAO 等［5］研究发现在哮喘中LRG1 参与了正常的支气管上皮纤毛细胞和Clara 细胞化生为杯状细胞的过程，促使杯状细胞的数量增加，该过程中白介素13（interleukin-13，IL-13）是诱导支气管上皮细胞化生的主要细胞因子，细胞因子IL-13 通过诱导与哮喘发生的相关的细胞因子肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白介素14（interleukin-14，IL-14）的产生并与之结合，而这些细胞因子会使上皮细胞内表达LRG1的基因表达上调，促进LRG1的转录和分泌，LRG1 又通过调节TGF-β通路进一步刺激TNF 和IL-14 细胞因子的产生，这些细胞因子又与IL-13 结合导致支气管上皮细胞化生，使气道分泌物增加炎症反应加重，长此以往恶性循环，促使疾病发展。

3.4 LRG1通过TGF-β通路与炎症性肠病TNF-α参与LRG1的表达并参与炎症的发生，Shirai R 等人研究发现通过以剂量依赖性的方式给小鼠注射脂多糖（LPS）可诱发急性炎症，在TNF-α的刺激下，LRG1 mRNA的表达量在12 ～24 h 内逐渐增加。而在IL-6 刺激后，LRG1 mRNA的表达量迅速增加了5 倍，6 h的达到最大值。同时发现TNF-α和IL-6 对LRG1 mRNA的表达有协同作用。利用IL-6 和TNF-α的结合所产生的LRG1的mRNA的表达量比IL-6 单独诱导表达的总和分别高出1.5倍［4］。而SHIRAI 等［34］在溃疡性结肠炎患者血清中IL-6 与TNF-α同样有协同刺激LRG1 表达的作用，而通过治疗，LRG1的水平下降超过30%的溃疡性结肠炎患者中，通过内镜下复查观察到疾病无明显进展，提示LRG1 作为一种可靠的、有益的监测标记，并具有替代血清CRP 预测溃疡性结肠炎的潜在诊断价值的生物学标记物。

4 LRG1 通过TGF-β通路参与肿瘤的发生发展

4.1 LRG1 通过TGF-β通路促进肿瘤血管生成血管生成是一个重要的生物学过程，是发育、生殖以及损伤组织修复的必要条件。然而，异常的血管生成在多种疾病尤其是在肿瘤的发生过程中起着重要的作用，最新研究发现，LRG1 能够促进血管的生成，尤其是异常血管的生长。对于LRG1 蛋白调控肿瘤血管生成的相关机制研究较少，最新研究表明LRG1 是通过调控TGF-β信号来发挥其促进血管生成的作用，在一些癌细胞中发现TGFβ1、TGFβRⅡ和LRG1的表达水平可同时升高［18］。RADGONDE 等［35］研究发现在视网膜母细胞瘤组织中LRG1 过表达，并通过调节TGF-β信号来促进血管生成，该研究观察到在小鼠视网膜母细胞瘤中，肿瘤中央的血管和周围缺血的区域都观察到LRG1 免疫活动，同时LRG1 和CD31、Ki-67 存在共定位现象，并与Ki-67 通过抑制负转录调控促进肿瘤细胞增殖。在缺氧/缺血的诱导下LRG1 存在过表达现象，而抑制LRG1的表达或使其表达减少，肿瘤则表现出明显退缩现象。结直肠癌中LRG1通过激活低氧诱导因子-α（hypoxia inducible factors α，HIF-α）促进肠癌中血管生成［36］。三期结直肠癌中，LRG1的表达与临床分期、组织学分级、脉管侵犯及肿瘤组织微血管密度（microvessel density，MVD）密切相关，且作为循环肿瘤标记物在灵敏度及特异度上有着更大的优势［37-38］。

4.2 LRG1通过TGF-β通路参与细胞凋亡LRG1通过TGF-β通路参与细胞凋亡，研究发现LRG1 通过通过TGF-β-Smads 通路上调细胞周期关键因子RUNX1、cyclin D1、B、E 和Bcl-2的表达，降低Bax蛋白的表达和caspase-3的裂解进而调节结肠直肠癌的细胞周期和细胞增殖，敲除LRG1 发现直肠癌细胞株其增殖速率降低了，而沉默LRG1 上述因子的表达水平的下降抑制凋亡作用减弱，使G0/G1期的细胞数量的增加，S 和G2/M 阶段的细胞数量减少降低细胞增殖速率［39-40］，在胶质瘤中的研究表明，对LRG1的沉默抑制了细胞增殖，在G0/G1 期诱导细胞周期骤停，并加速了胶质瘤细胞株在体外的凋亡。该研究法相LRG1 沉默导致cyclin D1、B、E 和凋亡调控基因Bcl-2 下降，同时促凋亡的Bax 和caspase-3的裂解增多，抑制LRG1的表达，有效地降低了U251 细胞的致瘤性，延缓肿瘤的形成，促进了异种移植肿瘤模型在体内的凋亡［41-42］。

4.3 LRG1 通过TGF-β通路来促进EMT 过程TGF-β在肿瘤侵袭中的另一重要作用是参与上皮细胞向间质细胞的转变（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）［43］，EMT 是上皮细胞失去极性，细胞之间连接能力，转变为间质细胞特性和形态的过程，是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，所以EMT被认为是肿瘤进展的重要过程。而肿瘤侵袭中，TGF-β信号通路已被证明在EMT 过程中发挥重要作用［44-46］。

TGF-β与TGFβ受体结合后通过激活Smads 信号通路促进EMT 过程；TGF-β活化后与TGFβRⅡ及或募集而来的TGFβRⅠ结合并形成配体受体复合物，同时下游的Smad2 和Smad3 磷酸化，Smad2/3并与Smad4 蛋白结合成三聚体并转运到细胞核中，与转录因子相互作用，调节EMT 特异性基因如SNAIL、ZEB 和TWIST的表达，调节EMT 相关蛋白的表达，一方面促进N-钙黏蛋白（N-cadhrein）、基质金属蛋白酶（MMP）、纤维蛋白等表达，另一方面下调E-钙黏蛋白（E-cadhrein）、紧密连接相关蛋白（Occludin）等的表达，导致细胞间紧密连接解体，ZO 蛋白、钙黏蛋白、闭合蛋白等的重新分布，粘附性复合物的破坏及细胞骨架的重组，从而使细胞侵袭和迁移能力增强［47］。在脑胶质瘤研究中LRG1 表达增高上调TGF-β1 表达，并通过TGF-β依赖Smads 通路，促进其下游Smads 蛋白磷酸化，促进EMT，从而增强细胞侵袭和迁移能力［48］。此外LRG1 也可以通过非依赖Smads 通路促进细胞侵袭，包括：有丝分裂激活蛋白激酶（MAPK）、Rho样鸟苷三磷酸酶和磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT 等，来促进上皮细胞向间质细胞的转变过程。研究发现，采用miR-335 直接针对TGF-β的非Smad 依赖型的通路，抑制Rho-关联ROCK1 和MAPK1 蛋白的基因，降低了肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化水平，从而显著抑制了神经母细胞瘤细胞的侵入性和迁移潜力［49］。而miR-335 同样针对LRG1的信使RNA，导致MLC的磷酸化状态显著降低，减少了神经母细胞瘤细胞的迁移和入侵［50］。这些研究说明LRG1 可以通过依赖Smads 或非依赖Smads的途径影响TGF-β信号通路促进EMT，增强肿瘤细胞的侵袭转移能力。但不同组织细胞，LRG1的作用也不尽相同，这有助于解释TGF-β信号的表型反应的多样性，以及调控的复杂性。

5 展望

综上所述，免疫炎症性疾病及肿瘤对人类健康威胁是医疗工作者始终关注的问题，探究新的治疗药物及方案，减轻病人的经济负担及疾病发展尤为重要，具有重要的临床乃至社会意义。LRG1 是新发现的TGF-β 重要上游信号分子，通过TGF-β 信号通路影响多种病理过程，虽然LRG1 在炎症性疾病及肿瘤的发生发展中的研究尚处于起步阶段，临床证据尚较匮乏，主要体现在LRG1 蛋白的表达及功能上，但目前专门针对LRG1的单克隆抗体Magacizumab 已处与Ⅰ、Ⅱ期临床试验阶段［35］。相信随着LRG1 与TGF-β 信号通路在相关疾病机制的研究不断深入，LRG1 可以为治疗炎症性疾病及抗肿瘤提供新的方向及策略。