自噬在胰岛β细胞存活中的作用及游离脂肪酸对其调控的分子机制研究进展

冯晓桃，段慧明，程永芳

(1广西中医药大学 广西中医基础研究重点实验室，南宁530200；2广西中医药大学中医药科学实验中心)

2型糖尿病(T2DM)已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题之一。现代医学研究认为，除外胰岛素抵抗，胰岛β细胞进行性衰竭在T2DM发生发展中起关键作用。因此，保护和促进胰岛β细胞存活成为防治T2DM的重要策略。T2DM往往伴有脂质代谢紊乱，表现为高游离脂肪酸(FFA)血症[1]。高水平FFA不仅能够通过抑制胰岛素信号通路如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路，进而抑制胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取和利用，引起胰岛素抵抗[2,3]，而且还损伤胰岛β细胞，甚至导致细胞凋亡[4]。同时，FFA还诱导胰岛β细胞产生自噬，保护细胞免受损害[5]。因此，研究FFA调控胰岛β细胞自噬的分子机制有助于促进保护胰岛β细胞的药物研发。现将自噬在胰岛β细胞存活中的作用及FFA对其调控的分子机制研究进展综述如下。

1 自噬在维持胰岛β细胞存活中的作用

1.1 自噬流及其调控机制 自噬是真核细胞借助溶酶体降解其胞质蛋白、细胞器等成分，从而维持细胞稳态的一个调控过程。当细胞感受到自噬信号，如饥饿、缺氧、外界压力、细胞器损伤、微生物感染等，细胞就会在胞质内形成一膜状结构，并不断扩张，逐渐形成新月形的脂质双层结构，即自噬泡；自噬泡不断延伸，并将其周围的细胞器如内质网、线粒体等物质成分包裹，形成环状双层膜结构的自噬体；自噬体随后与溶酶体结合形成自噬溶酶体，溶酶体酶随之将包裹的内容物降解，并产生氨基酸、脂肪酸等，供细胞利用。在此过程中，自噬泡和自噬体是产生自噬的形态学特征；同时，胞质内微管相关蛋白1轻链3(LC3)经酶解作用形成胞质型LC3-Ⅰ，然后转变为膜型LC3-Ⅱ，定位于自噬体膜上，成为自噬的生化标志。事实上，自噬过程(即自噬流)受自噬相关基因(ATG)严密调控。在自噬的起始阶段，ATG1能募集ATG11、ATG13、ATG17等形成复合物，从而诱发自噬；随后形成ATG12-AGT5-AGT16L1多聚体，促进LC3蛋白转变和定位;同时AGT6(Beclin-1)与ATG14等一起作用于经典的Ⅲ型PI3K，促进形成自噬体膜和自噬体；而ATG2-ATG9-ATG18复合物形成则调控着ATG蛋白从成熟自噬体分解，并再循环利用[6]。

另外，自噬流还受其上游信号通路所调控。在这些信号通路中，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是其关键的负性调控激酶，受Ⅰ型PI3K/Akt信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/胞外信号活化激酶1/2(ERK1/2)信号通路激活而抑制自噬流，被AMP活化蛋白激酶(AMPK)信号通路和p53信号转导所抑制而促进自噬。此外，AMPK信号通路和Ⅲ型PI3K信号通路还可以通过不依赖于mTOR就能诱发自噬。活化的mTOR能够磷酸化ULK1(ATG1同源类似物)的Ser757位点，并破坏AMPK与ULK1之间的联系，抑制自噬信号；相反，在营养不足的情况下，AMPK能够直接作用于ULK1，导致ULK1多个位点磷酸化，包括Ser317和Ser777，进而促进细胞自噬。

1.2 自噬与胰岛β细胞的关系 自噬在细胞生长、发育和老化等过程中都起着重要的作用。适度自噬可以更新细胞器和蛋白质，从而维持细胞内环境稳定；而且，自噬产生的氨基酸、脂肪酸等物质又可以重新被利用，提供能量。自噬作为细胞的一种防御机制，可以清除应激状态下受损的细胞器和蛋白质，进而保护细胞免受损害和维持细胞存活。研究表明，自噬对于维持胰岛β细胞数量、结构和功能是必不可少的。胰岛β细胞缺乏自噬功能可导致细胞增殖能力下降、死亡增加、体积减少、胰岛素含量下降和葡萄糖刺激胰岛素分泌减少以及机体高血糖、糖耐量损伤和低胰岛素血症[5,7]，而维持自噬功能可以保护胰岛β细胞免受内质网应激等所介导的细胞损伤[8]。

2 FFA调控胰岛β细胞自噬的分子机制

2.1 FFA对胰岛β细胞mTOR依赖性信号通路的影响 长期高水平FFA促使胰岛β细胞产生自噬，表现为细胞自噬泡和自噬体显著增加，LC3-Ⅱ蛋白表达升高以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值增大。进一步研究显示，饱和脂肪酸棕榈酸(PA)能够显著抑制胰岛β细胞mTOR、Akt和ERK磷酸化，而对mTOR和ERK蛋白表达无明显影响[9～11]。抑制mTOR、Ⅰ型PI3K或Akt活性可以进一步提高PA诱导的自噬水平，并预防其诱导的细胞凋亡[9,11]。但也有报道发现，PA能够提高胰岛β细胞Akt和mTOR磷酸化水平，从而激活mTOR信号通路，抑制自噬转化，进而提高自噬体和自噬底物表达水平，而抑制mTOR显著降低了PA诱导的细胞凋亡[12]。

2.2 FFA对胰岛β细胞非mTOR依赖性信号通路的影响 在胰岛β细胞NIT-1中，PA能够提高其自噬水平，但细胞AMPK蛋白表达及其磷酸化水平却下降，而mTOR蛋白表达则升高，表明脂肪酸可以通过非mTOR途径调控胰岛β细胞自噬[13]。

2.2.1 FFA通过内质网应激诱导胰岛β细胞自噬 内质网应激的特点是细胞内质网未折叠或错误折叠蛋白集聚。未折叠或错误折叠蛋白增多可被内质网膜上的感应器包括蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、肌醇需求酶1α(IRE1α)和转录活化因子6(ATF6)所感知，触发了未折叠蛋白反应(UPR)。活化的PERK磷酸化真核起始因子2α(eIF2α)，从而减少蛋白质合成，减轻内质网负担，并提高ATF4翻译；IRE1α活化则提高X盒结合蛋白1(XBP1)翻译；而ATF6在高尔基水解后释放活性转录因子和促进XBP1转录。这些活性转录因子能够增加伴侣蛋白和蛋白折叠酶的合成，诱导未折叠、错位折叠蛋白降解。因此，适度UPR有利于维持细胞存活和生理功能。但当内质网处理蛋白能力下降，或未折叠/错误折叠蛋白过度集聚，超过了内质网自身处理能力时，适度UPR就会向凋亡式UPR转变，引起细胞凋亡。胰岛β细胞富含内质网，蛋白合成与分泌十分活跃，容易诱发内质网应激。事实上，T2DM患者胰岛存在明显的内质网应激。研究显示，高水平PA能诱发胰岛β细胞内质网应激[14]，并通过C/EBP同源蛋白(CHOP)实现了适度UPR向凋亡式UPR转变[15～17]。活化的CHOP能够下调抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL表达，而上调促凋亡蛋白Bax表达，继而激活凋亡执行蛋白Caspase-3，导致胰岛β细胞凋亡[4,18]。此外，PA在诱导INS-1细胞内质网应激的同时还伴有Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达升高[19]。高脂饮食也能够提高大鼠胰岛细胞Beclin-1蛋白表达和降低Bcl-2/Bcl-XL蛋白表达[20]。研究已表明，Bcl-2/Bcl-XL能够作用于Beclin-1，进而抑制自噬。一方面，Bcl-2/Bcl-XL蛋白表达下降解除了其对Beclin-1的抑制；另一方面，高表达的Beclin-1又能够挣脱低表达的Bcl-2/Bcl-XL蛋白控制，进而促进自噬。此外，FFA还能通过激活内质网应激下游的c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路，进而抑制PI3K/Akt信号转导，促进胰岛β细胞自噬[9,18,21]。而且，活化的JNK还能够磷酸化Bcl-2，抑制Bcl-2和Beclin-1之间的作用，促使Beclin-1释放[22]，诱发自噬。抑制JNK可解除PA对Akt磷酸化的抑制，进而减少自噬[9]。研究表明，增强自噬可以降低胰岛β细胞内质网应激，减少细胞凋亡[23]；而通过敲除Beclin-1或ATG5抑制自噬则增强了内质网应激[24]。可见，脂肪酸诱导胰岛β细胞产生自噬至少部分是细胞对其诱导的内质网应激等损害所作出的一种防御性反应，以清除未折叠、错误折叠蛋白以及衰老、受损的细胞器，从而维持细胞内环境的稳定。

2.2.2 FFA通过氧化应激诱发胰岛β细胞自噬 氧化应激是机体受到刺激，体内氧化和抗氧化能力失衡，活性氧簇(ROS)、氮簇或自由基等产生增多，超出了自身清除能力，导致组织和细胞发生氧化损伤的病理过程。ROS包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)和羟基(HO-)。胰岛β细胞产生ROS有线粒体和非线粒体途径。在线粒体内，电子流通过电子传递链并依赖线粒体内膜4个酶复合物、细胞色素C(Cyt C)和移动载体辅酶Q进行传递。在传递过程中，O2-主要依靠复合物Ⅰ和Ⅲ产生。O2-不具有膜渗透性，但非常活跃，能够在超氧化物歧化酶(SOD)作用下转变为H2O2。H2O2是一非极性、能通过水孔蛋白自由扩散的小分子，活性明显小于O2-，并在外部刺激下迅速合成和消失。H2O2在过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化物氧化还原酶(Prx)的作用下，最终被催化成为氧气(O2)和水。在线粒体外，磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶能够将电子转运到O2，触发产生ROS。此外，胞质中多个氧化还原酶也能催化产生ROS。研究发现，胰岛β细胞胞质和线粒体SOD水平是肝脏的50%，而CAT、GPx仅是肝脏的1%，表明胰岛β细胞抗氧化能力不足，容易发生氧化应激。事实上，T2DM患者胰岛细胞确实存在氧化应激和细胞损伤[25]。长期高水平FFA通过线粒体途径和NADPH氧化酶途径诱导胰岛β细胞氧化应激，产生大量ROS，包括H2O2和O2-，同时伴有Bcl-2蛋白表达下降和Caspase-3活性升高以及明显的细胞凋亡。抑制氧化应激进而减少ROS产生可以维持Bcl-2蛋白表达和抑制Caspase-3活性，从而减轻细胞凋亡。研究表明，Bcl-2能够调控ROS信号途径，抑制Bcl-2能够促进线粒体质子渗漏和SOD活性，提高ROS水平[26]，导致氧化应激的恶性循环。因此，脂肪酸可通过诱导胰岛β细胞氧化应激，降低Bcl-2表达，进而减少Bcl-2和Beclin-1之间的作用，实现对自噬的调控[4,19]。此外，ROS能渗透到内质网，触发内质网应激[27]，进而诱导自噬[19,28]。据报道，PA通过激活氧化应激以及随后的JNK和p38MAPK信号通路促进了心肌H9C2细胞自噬，抗氧化应激可以抑制JNK和p38MAPK活性以及细胞自噬，而抑制JNK或p38MAPK活性则减少了自噬[29]。

2.2.3 其他 在敲除了CHOP进而抑制内质网应激的胰岛β细胞，PA诱导的JNK磷酸化水平并未完全受抑制[15]，而体内敲除CHOP也未明显影响JNK活性[17]。这些表明，JNK活化存在着非内质网应激依赖性途径。进一步研究显示，PA能够促进双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)磷酸化，进而激活JNK1[30]。活化的JNK磷酸化Bcl-2，进而干扰Bcl-2和Beclin-1之间的作用，诱发自噬[24,30]。相反，抑制JNK活性则阻断了PA诱导的胰岛β细胞自噬[30]。此外，PA诱导的自噬可以被Ⅲ型PI3K抑制剂所抑制[11,31]，表明PA可以通过Ⅲ型PI3K信号通路调控胰岛β细胞自噬。

综上所述，自噬在维持胰岛β细胞存活与功能中起着重要的作用，FFA可诱导胰岛β细胞产生自噬。因此，阐明FFA调控胰岛β细胞自噬的分子机制将为开发保护和促进胰岛β细胞存活的药物提供潜在的作用靶点。FFA可通过mTOR依赖的PI3K/Akt和ERK信号通路以及内质网应激、氧化应激途径、PKR/JNK信号通路和Ⅲ型PI3K信号通路诱导胰岛β细胞自噬。尽管如此，FFA调控胰岛β细胞自噬的分子机制尚未完全清楚。一方面，FFA能够改变细胞膜脂质构成，而磷酸肌醇结合蛋白涉及到自噬，那么胞膜脂质成分的改变是否会影响到磷酸肌醇结合蛋白进而调控自噬呢？这需要进一步研究。另一方面，FFA作为一种能量物质，在细胞内能够代谢生成ATP供细胞利用。但据报道，在PA孵育的人胰岛内ATP水平是下降的[12]，而AMPK表达及其活性却下降或无改变[12,13,30]；胰岛β细胞在缺乏营养时，自噬受到抑制。因此，有必要明确FFA是否改变了胰岛β细胞能量代谢，进而影响到自噬。