细粒棘球蚴病的研究进展

米吉提·莫合他尔汗

（新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁 木齐 830063）

囊型包虫病（Cystic echinococcosis），是由隶属于带科（Taeniidae）棘球属（Echinococcus）的细粒棘球绦虫（Echinococcus gramsloses）的中绦期虫引起的一类人兽共患寄生虫病，该病呈世界性分布，严重危害公共卫生[1]。细粒棘球蚴主要寄生于人、野生和家养的有蹄类动物（中间宿主）的器官组织中，以肝脏最为常见，其次是肺部，并形成包囊[2]。

主要流行于牧区，不仅严重威胁牧民的生命健康，还给当地畜牧业的发展带来了巨大经济损失，该病的流行受生物、社会、环境等因素的影响，具有地方流行性，是一个重要的公共卫生问题。我国已经将 棘球蚴病列入2012～2020年的《国家中长期动物疫病防治规划》中，作为重点防范和优先防治的动物疫病。目前，在我国33个省/自治区当中，已有20多个地区发布了感染病例的报道。

1 生活史

棘球绦虫必须依赖两种哺乳动物宿主才能完成其生活史。经过虫卵，棘球蚴和成虫三个阶段。成虫寄生于犬科动物和猫科动物的小肠内，孕节片或虫卵随粪便排出；细粒棘球绦虫的虫卵由有蹄动物中间宿主食入虫卵，从而发育成棘球蚴，随后 棘球蚴在肝、肺和其他脏器中发育生长，直到棘球蚴被终宿主吞食后在其小肠内发育为成虫。人感染棘球蚴后可在肝、肺等器官形成占位性病灶。

2 中间宿主

细粒棘球绦虫主要在家畜中循环，其中间宿主主要为有蹄类家畜（例如绵羊、牛、猪、山羊、马、骆驼）。

3 终末宿主

狗、狼、狐、豺等为终末宿主。

4 包虫病的检测技术

包虫病是我国西部地区农牧民因病致贫和因病返贫的主要疾病之一，同时也是影响畜牧业发展的重要疾病。包虫病的中间宿主（包括人、牛、羊等）对人类的包虫病的免疫应答研究较多，但大多涉及临床症状表现后开展的研究。对于患者的背景及感染剂量方面的研究报道较少，大多数包虫病手术患者在术后往往有继发性感染的可能。同时，一般包虫病患者在进行诊治时，都已经是患病的后期，在感染初期，患者很难被确诊。目前，通常以影像学和免疫学诊断技术相结合进行包虫病的确诊。也有很多分子生物学技术可用于包虫病诊断。

对中间宿主开展免疫诊断时，可用囊液、粗提原头节蛋自为包被抗原进行酶联免疫吸附实验（ELISA）检测，粗提原头节蛋自的敏感性和特异性较高。抗原B （AgB）是由细粒棘球蚴病病原性幼虫产生的高丰度蛋白，是由原头节和包囊合成和分泌的。E.gAgB具有很好的免疫原性，能够识别出80%包虫病患者，在调节宿主免疫应答反应中具有很重要的作用。E.g AgB家族在E.g差异表达的5个发育阶段中至少含有10个单一基因。对两个国家采集到的病理材料进行分析，结果表明每一个基因在E.g幼虫和成虫阶段是完全相同的。将其DNA序列与Genbank上的基因进行比较，发现它们在五g发育过程中是高度保守区，但是E.g AgB具有明显的变异和多态性。同时差异PCR结果显示，这些基因在E.g生活史的不同阶段的表达存在差异，只有E.gAgB3在所有生活阶段都表达。

包虫病的检测技术抑制差减杂交（suppressionsubtractive hybridization，SSH）是一种高效鉴定和分离克隆差异表达基因的新技术。该技术以高效、便捷和假阳性率低等优势受到广大研究人员的重视，在分子生物学研究领域得到了广泛的应用。目前，该技术在寄生虫学研究中的应用不是很多，主要应用在寻找与寄生虫不同发育阶段相关的差异表达基因和与寄生虫抗药性相关的差异表达基因以及其他相关基因的研究，如与不同虫株、不同宿主或性别差异相关的基因。在细粒棘球绦虫发育过程中，可通过此技术得到不同发育期差异表达的基因，并将这些基因用于诊断和防治包虫病。

实时荧光定量PCR （real-time PCR）是指在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号累计监测整个PCR过程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。其荧光检出方法可分为荧光嵌合法和荧光探针法两大类。荧光嵌合法通常使用SYBRGreen I，它是一种能够与所有dsDNA双螺旋小沟区域结合的具有绿色激发波长的染料，它与PCR合成的双链DNA结合，在激发光照射下产生荧光，通过荧光强度的监测，可以实时检测PCR扩增的产物量。荧光探针法通常使用水解探针Taqman探针，它是两端标记了荧光基团的寡核昔酸探针，末端为淬灭基团，末端为荧光基团。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与端的淬灭基团接近而被淬灭，也称为荧光共振能量转移（fluorescence reso-nance energy transfer，FRET），当进行延伸反应时，聚合酶的外切酶活性可切除探针，使得荧光基团与淬灭基团分离。常用的荧光基团有FAM，V1C和NED等，淬灭基团有TAMRA，DAB CYL和BHQ等。Realtime PCR是一种准确、快速的核酸定量分析方法，也是定量研究基因表达水平最为有效的方法之一，这将为包虫病特异基因筛选提供有利的技术支撑。

5 单克隆抗体

动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，选择性表达出不同基因的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个表达不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

6 单克隆抗体的基本原理

要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。

7 单克隆抗体诊断的运用

利用成虫抗原免疫动物以获抗体国内仅见多克隆抗体，有的用成虫多克隆抗体建立粪抗原检测方法。国外已有检测犬粪中成虫的商品试剂盒，其中有使用单克隆抗体的也有使用多克隆抗体的。但是多克隆抗体批次与批次问的特异性与亲和力不同，抗原抗体容易形成格了结构（沉淀反应），特异性低。单克隆抗体则特异性识别单一抗原决定簇，特异性高，抗体均一。用单克隆抗体建立的检测方法具有上述的优点，有着多克隆抗体无法相比的优势，本研究利用杂交瘤技术建立了1株能持续稳定分泌抗包虫成虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细粒棘球绦虫成虫虫体抗原与原头节虫体抗原之问存在着很高的交义反应，不同的组分主要在成虫有孕节及内含的虫卵，表明这两采用Th1类细胞因了IFN-γ，IL-2等的编码基因作为基因佐剂与保护性蛋白编码基因串联装入含有CMV强启动了质粒pcDNA。

总之，从我国对家畜包虫病防控工作已取得的成果表明，只要阻断细粒棘球绦虫循环链中终末宿主家/牧犬排泄虫卵（传染源），便可控制包虫病的传播。即通过实施“犬犬投药，月月驱虫”控制模式，就可使新疆包虫病在很短时间内由高发控制到低水平。