槐耳清膏对乳腺癌细胞microRNA表达谱的影响

鲁明骞，陆海燕，冯雪松，高嫣，李莉娥，李薇，张蓉，孔庆志

(1三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院，湖北宜昌443000；2宜昌人福药业有限责任公司；3武汉市中心医院 武汉市肿瘤研究所)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，2015年世界卫生组织统计，女性因乳腺癌而死亡占各种肿瘤死亡的首位[1]。在我国，乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤的第一位。手术联合放疗、化疗、内分泌、靶向药物、免疫和中医中药等综合治疗是乳腺癌的主要治疗方式，经过规范的治疗，大部分乳腺癌患者是可以治愈的，但部分患者在初诊时即为中晚期，不能完全根治[2]。因此，进一步了解乳腺癌的发病机制，寻找新的药物和新的靶点，对提高乳腺癌的治愈率和生存率、改善生活质量有重要意义。目前研究发现，微小RNA(microRNA)与多种恶性肿瘤密切相关[3～7]，在肿瘤诊断、治疗与预后中发挥着重要作用。因此，microRNA有可能成为肿瘤诊断、治疗和预后的一个潜在的生物标志物。既往研究发现，槐耳清膏在乳腺癌中可发挥抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、降低放化疗毒副反应、提高乳腺癌术后化疗患者的免疫功能等作用[8～11]，但其机制尚不明确。2013年5月～2015年8月，我们对槐耳清膏作用于乳腺癌雌激素受体阳性(ER+)的MCF-7细胞及雌激素受体阴性(ER-)的MDA-MB-231细胞中microRNA表达谱的影响进行研究，初步探讨乳腺癌细胞中microRNA的表达谱变化，为研究槐耳清膏治疗乳腺癌的分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料 乳腺癌细胞(MCF-7及MDA-MB-231)购自美国Amercian Type Culture Collection(ATCC)。PRM-1640培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶购自上海碧云天生物技术有限公司；二甲基亚砜购自Amersco公司；TRIzol购自美国Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；荧光素报告基因检测试剂购自美国Promega公司；TaqMan microRNA逆转录试剂盒、mirVana TmmicroRNA Isolation Kit试剂盒购自德国Qiagen公司。

1.2 细胞培养 MCF-7及MDA-MB-231细胞于5×105/孔平铺于六孔板中，5% CO2、37 ℃培养24 h，分别加入浓度为9 mg/mL槐耳清膏(槐耳清膏组)和相同体积的PBS(对照组)，5% CO2、37 ℃继续培养24 h，待提取RNA。

1.3 microRNA的筛选 利用荧光实时定量PCR法。根据mirVana TmmicroRNA Isolation Kit试剂盒要求提取两种细胞的RNA，分光光度计测定260 nm及280 nm的吸收值，评估RNA的纯度和浓度，并采用Agilent Bioanalyzer 2100评价总RNA质量。上述实验重复3次。microRNA测定由博奥生物技术有限公司完成。将3次实验提取的RNA混合，加入100 ng总的RNA去磷酸，用pCp-Cy3标记，标记后的microRNA与Agilent人类microRNA杂交，经清洗、扫描，由Feature Extraction10.7软件提取。用TRIzol提取总的RNA，异丙醇沉淀浓缩RNA，分光光度计定量。microRNA分离，芯片筛选出乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231细胞中上调和下调的microRNA。以荧光信号强度的比值log2(ratio)<-1或>1为显著性差异表达microRNA。

2 结果

2.1 MCF-7细胞microRNA表达谱变化 槐耳清膏作用于乳腺癌MCF-7细胞后，表达上调的有miR-7-5p、miR-21-5p、miR-100-5p、miR-125b-5p、miR-126-3p、miR-328-5p，表达下调的有miR-10b-5p、miR-31-5p、miR-127-3p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-146-5p、miR-199a-5p、miR-200b-5p、miR-205-3p、miR-206、miR-210-5p、miR-218-5p、miR-221-3p、miR-326、miR-340-5p、miR-335-5p、miR-345-5p、miR-375、miR-373-3p、miR-451a、miR-520a-3p。miR-7-5p、miR-21-5p、miR-126-3p在MCF-7细胞系中上调最明显。

2.2 MDA-MB-231细胞microRNA表达谱变化 槐耳清膏作用于MDA-MB-231细胞后，表达上调的有miR-10b-5p、miR-21-5p和miR-127-3p，表达下调的有miR-7-5p、miR-31-5p、miR-100-5p、miR-125b-5p、miR-126-3p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-146-5p、miR-199a-5p、miR-200b-5p、miR-205-3p、miR-206、miR-210-5p、miR-218-5p、miR-221-3p、miR-326、miR-328-5p、miR-340-5p、miR-335-5p、miR-345-5p、miR-375、miR-373-3p、miR-451a、miR-520a-3p。miR-10b-5p、miR-21-5p在MDA-MB-231细胞系中上调显著。

2.3 两种细胞中共同变化的microRNA 在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，表达共同上调的是miR-21-5p，共同下调的有miR-31-5p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-146-5p、miR-199a-5p、miR-200b-5p、miR-205-3p、miR-206、miR-210-5p、miR-218-5p、miR-221-3p、miR-326、miR-328-5p、miR-340-5p、miR-335-5p、miR-345-5p、miR-375、miR-373-3p、miR-451a、miR-520a-3p。

3 讨论

癌症的发生和发展是多因素参与、多基因改变及多阶段发展的复杂生物学过程，其分子调控机制目前仍未完全明确。microRNA是一类长度18～25 nt的非编码RNA，能影响蛋白质的表达，是一类十分重要的转录后调控因子，参与并调控人类约30%的编码基因。microRNA具有高度的保守性和器官组织特异性，通过调控靶基因的表达，对细胞发育、增殖、分化和凋亡等有一定作用。microRNA是基因调控中的核心成分，在癌症发生中有些具有癌基因作用，可促使肿瘤的发生；有些则具有抑癌基因的作用，能抑制肿瘤的生长，同时也参与癌症的增殖、浸润、血管生成、凋亡及信号转导通路等环节[12,13]。目前研究发现2 000多个microRNA能调控大约1/3的人类基因表达[14]。随着基因芯片和高通量测序技术的出现以及研究的进一步深入，microRNA的特点和功能被进一步认识。研究发现，不同的肿瘤甚至组织分类及分子分型都具有特异相关的microRNA表达谱[15,16]。因此可通过基因芯片和高通量测序技术的应用筛选肿瘤特异相关的microRNA表达谱，从而为肿瘤的早期诊断及靶向治疗提供特异有效的靶点。

刘冬冬等[17]对乳腺癌患者血清中差异表达的microRNA表达谱进行分析，通过高通量测序技术筛选出28个差异性表达的microRNA，认为血清中hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-320a这4种microRNA有可能作为乳腺癌诊断的潜在标志物。而Sochor等[18]研究发现，早期乳腺癌患者治疗后血清miR-155、miR-181b、miR-19a、miR-24 的表达水平下调，其表达水平与乳腺癌风险程度及治疗效果相关。对于三阴性乳腺癌中差异表达的microRNA表达谱，Sylwia等[19]认为miR-190a、miR-136-5p、miR-126-5p、miR-135b-5p和miR-182-5p可能与三阴性乳腺癌的发生发展有关。

槐耳用于治疗恶性肿瘤已有1 000多年的历史，其主要抗癌成分为槐耳蛋白多糖(PS-T)，功能是抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、减少细胞迁移和侵袭、逆转细胞耐药、提高患者免疫功能和生活质量[20,21]。本课题组前期结果表明，槐耳清膏能抑制裸鼠移植瘤的生长，降低MCF-7细胞成瘤能力和细胞生长成瘤性，抑制细胞增殖[22]。槐耳清膏对乳腺癌细胞增殖抑制与细胞凋亡、细胞周期调控、核苷酸转移酶活性等因素密切相关，表明槐耳清膏对乳腺癌细胞的增殖抑制和抗肿瘤机制有赖于其它诸多基因的相互调控，是一个多步骤、多阶段的发展过程。本研究通过基因芯片筛查经槐耳清膏和PBS处理的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞系中差异表达的microRNA，发现槐耳清膏在有效抑制乳腺癌细胞增殖的同时，对乳腺癌细胞的microRNA表达也有影响，使MCF-7细胞中6个microRNA表达上调，21个表达下调，表达上调显著的microRNA有miR-7-5p、miR-21-5p、miR-126-3p；使MDA-MB-231细胞中表达上调的microRNA有3个，表达下调的有24个，表达上调显著的有miR-10b-5p和miR-21-5p。槐耳清膏作用于乳腺癌细胞后，通过异常表达的microRNA，直接或间接抑制肿瘤细胞的生长，促进细胞的凋亡，从而达到抗肿瘤的作用。

既往研究表明，miR-7-5p和miR-126-3p作为抑癌基因具有抑制肿瘤的发生和发展，槐耳清膏作用于乳腺癌细胞后，使miR-7-5p表达上调，细胞周期被阻滞于G0/G1期，从而抑制乳腺癌细胞的增殖[23]；而miR-126-3p表达上调，其增殖、迁移和侵袭等能力显著抑制，细胞凋亡明显增强[24]，从而达到抗肿瘤的作用。miR-21-5p和miR-10b-5p在肿瘤组织中呈高表达[25,26]，具有促癌作用，槐耳清膏作用于乳腺癌细胞后，其表达应较低。但本研究发现其表达仍较高，其机制可能是在细胞信号传导通路中，miR-21-5p和miR-10b-5p通过调节靶基因的变化来实现抑制乳腺癌的作用[27,28]，但机制仍需进一步研究。因此，miR-7-5p、miR-10b-5p、miR-126-3p与miR-21-5p有可能作为药物治疗乳腺癌潜在的新的靶点，通过影响乳腺癌细胞增殖与发展过程，并可能作为乳腺癌诊断、治疗和预后的预测指标。

综上所述，槐耳清膏可影响乳腺癌细胞中microRNA表达水平，在抑制乳腺癌细胞增殖过程中可能通过microRNA及其调控的靶基因相关信号通路来实现的，这些差异表达的microRNA可作为乳腺癌治疗的新靶点，但其具体的分子机制有待进一步研究明确。