补肾活血中药对成骨细胞增殖、分化作用的研究进展*

李凯明，李玲慧，朱立国，王尚全，谢 瑞，张 清△

1.中国中医科学院望京医院脊柱二科(北京100102)；2.中国中医科学院望京医院骨伤综合科(北京 100102)

中医学认为“肾主封藏，受五脏六腑之精而藏之”，肾藏精，精生髓，髓居于骨中，以滋养骨骼。所以骨骼强劲，形体矫健，髓的生成，为“肾主骨”提供了物质基础，故“肾主骨充髓”。补肾活血方源自《伤科大成》，具有补肾壮骨，活血止痛之功效。通过补肾壮骨以治本，活血化瘀以治标，为临床应用中药治疗各类骨退行性疾病提供了科学依据。成骨细胞骨形成与破骨细胞骨吸收之间的平衡是维持正常骨量的关键，是维持骨代谢正常过程的重要核心细胞。成骨细胞在不同阶段释放重要的活性标志物，像碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素等及各种细胞因子，如胰岛素样生长因子(IGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、骨钙蛋白、转化生长因子β等促进新骨形成。同时对破骨细胞骨吸收的调控，维持骨的代谢平衡方面起到重要作用[1]。近年来研究发现，补肾活血方药在调控成骨细胞增殖、分化和功能作用方面具有一定的积极作用。本文将通过细胞、动物、临床个体水平三个方面进行简要综述。

1 细胞水平研究

1.1 补肾活血中药对成骨细胞增殖、分化作用 生物体最重要的生命活动是从细胞增殖、分化开始的，通过促进生物生长、发育、遗传和繁殖，完成创伤修复的基础生命活动。近年来,大量研究开始从分子生物学角度出发，探究中医中药对成骨细胞(OB)影响的作用机制,发现补肾活血中药对骨形成和骨折愈合至关重要。林举择等[2]通过分离和培养大鼠颅盖骨成骨细胞,采用实验MTT法观察成骨细胞存活和增殖能力，证实补骨脂有效成分在一定程度上对大鼠成骨细胞的增殖、分化方面具有明显促进作用。王永东等[3]通过观察发现,不同浓度黄芪水提液ALP活性显著高于NS对照组(P<0.01)；矿化结节计数亦显著高于NS对照组(P<0.01)。发现黄芪有效成分对成骨细胞体外增殖、分化及成骨能力受药物浓度的影响较大，并且具有双向调节作用。中药地龙提取物中含有较高活性的促成骨细胞增殖、分化和基质矿化的有效成分。通过对实验性牙槽骨吸收模型的治疗发现，其可抑制骨吸收，使破骨细胞数目减少，骨密度增高，促进成骨活动使其修复重建[4]。舒晓春等[5]通过制备骨碎补总黄酮含药血清，运用二次酶消化法，从新生SD大鼠颅骨中取得成骨细胞,发现其可以引起新生SD大鼠成骨细胞增殖,促进成骨细胞合成分泌ALP,且能增加成骨细胞骨钙素的分泌,促进矿化结节的形成。牛膝为苋科牛膝属植物干燥根，有散淤血、消肿痛、补肝肾、强筋骨之功效，为临床常用药物。研究发现，牛膝的醇提物及醇提物的乙酸乙酯萃取物脱皮甾酮对成骨样细胞UMR106有显著的促进增殖作用[6]。郭辉等[7]综合运用MTT法，RT-PCR法以及对硝基苯磷酸盐法，探究葛根素对成骨细胞的增殖、分化的作用机制。发现在不同浓度作用下，葛根素都可以提高成骨细胞增殖率，增强ALP活性，推动骨保护素mRNA的功能表达，从而抑制破骨细胞的分化和成熟。

1.2 补肾活血中药对骨髓间充质干细胞细胞增殖、分化作用 骨髓间充质干细胞(Bone mesenehyal stem cells，BMSCs)在组织细胞修复过程中扮演着重要角色，可以在不同条件诱导下向成骨细胞、脂肪细胞、成骨软细胞、心肌细胞、神经细胞等方面转化，是一类具有多向分化潜能的干细胞[8]。现代研究表明补肾活血中药调控BMSCs向成骨分化的机制，与《素问·阴阳应象大论》提出“肾主骨，生髓”具有相通性。所以临床上可以通过补肾活血来有效促进骨髓间充质干细胞向成骨分化。刘琳等[9]采用密度梯度离心法分离多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)患者骨髓间充质干细胞(MM-BMSC)及正常人骨髓间充质干细胞(ND-BMSC)，观察黄芪多糖对BMSCs增殖与细胞因子表达的影响，发现黄芪多糖促BMSCs增殖的作用明显。为临床治疗MM患者减少其骨质破坏提供了一定的实验依据。另有相关研究表明[10]，采用龟板含药血清对BMSCs进行体外干预，同时使用流式细胞术检测MSCs表面抗原CD44细胞标志,通过免疫化学染色、Western blotting、原位杂交、RT-PCR等方法，详细记录成骨分化标记分子碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)及VDR阳性表达及VDR mRNA的表达情况，从而探究龟板提取物对原代培养的MSCs向成骨分化的作用机制。发现龟板提取物诱导MSCs向成骨分化过程可明显促进VDR mRNA的表达，其机制可能与VDR的上调有关。Li等[11]通过发现女贞子提取物可以改善BMSCs碱性磷酸酶(ALP)活性，增加矿化结节数目，对BMSCs成骨分化具有重要促进作用。邓展生等[12]对骨碎补的有效成分柚皮甙对BMSCs增殖、分化的影响进行实验研究，发现碱性磷酸酶(ALP)活性、von kossa钙结节染色与空白对照组比较有明显差异(P<0.05)。说明柚皮甙能有效促进BMSCs增殖、分化，增强碱性磷酸酶的生物活性，从而加速矿化结节的形成。张贤等[13]观察杜仲诱导BMSCs成骨分化过程中Wnt通路相关信号分子表达，采用RT-qPCR法测定Wnt信号途径中Fzd和LRP受体系列、β-catenin、核内Wnt调控靶基因系列及Wnt抑制因子(WIF1)等变化。发现Wnt信号途径可能参与了杜仲促BMSCs的成骨分化过程。

2 动物水平研究

目前，研究使用最普遍的实验动物模型是SD大鼠模型，广泛用于药理、毒理、药效及GLP实验。通过胎鼠颅骨成骨细胞体外培养实验,观察补肾活血复方含药血清及原药液在成骨细胞及骨髓间充质干细胞增殖、分化及矿化的作用，从而探究骨代谢的过程。

2.1 补肾活血复方对SD大鼠成骨细胞增殖、分化及功能作用 取SD大鼠的颅骨，彻底剥离骨膜等软组织，对成骨细胞进行分离与培养。观察补肾活血复方对成骨细胞增殖、分化(ALP活性测定)、矿化功能测定。胡冰等[14]用补肾健脾活血方含药血清对SD大鼠成骨细胞进行治疗干预，发现其能明显增加成骨细胞增殖率和矿化结节形成数，明显改善骨密度和骨强度的作用，还可改善骨的显微结构，从而减少骨折的发生率。并且与含药血清浓度呈正相关。鞠大宏等[15]通过原位杂交法检测左归丸含药血清对成骨细胞OPG、RANKL mRNA的表达，发现左归丸含药血清可以促进成骨细胞分泌OPG，直接抑制RANKL的分泌，降低破骨细胞活性，从而维持骨骼的生物学性能和内环境稳态。林煜[16]等从成骨细胞整合素的功能状态及信号转导调控的研究对成骨细胞黏附的角度切入，探究健骨颗粒含药血清有效成分对成骨细胞的意义，实时荧光定量PCR法检测成骨细胞纤连蛋白、Ⅰ型胶原、玻连蛋白、黏着斑激酶mRNA的表达。结果发现健骨颗粒可以调节成骨细胞整合素和各种相关因子。使成骨细胞进入“分泌、黏附增加、功能增强、分裂增殖、分泌增加”的良性循环，促进成骨细胞骨形成。张荣华等[17]探究补肾活血液对新生SD大鼠成骨细胞增殖、分化、矿化的作用,分别用MTT法、对硝基苯基磷酸二钠(PNPP)法、放免分析方法和茜素红染色法测定细胞增殖功能、碱性磷酸酶(ALP)活性以及骨钙素(BGP)含量和矿化结节计数。进一步证实了中药复方补肾活血液对体外培养的新生SD大鼠成骨细胞的促进作用，可以提高骨量和改善骨质量。

2.2 补肾活血复方对SD大鼠成骨细胞增殖、分化作用机理 通过补肾活血复方对SD大鼠成骨细胞进行干预培养，可从动物水平探讨补肾中药防治骨质退化机制，不仅能为中医“肾主骨髓，其充在骨”理论提供客观理论依据，而且能更好地筛选出有效的临床方药。多数补肾活血方剂都是来源于临床实践，在此基础上结合现代成骨细胞分离培养技术，通过补肾活血方剂的含药血清或者提取物的干预，观察成骨细胞增殖、分化等指标的变化。通常将碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(BGP)含量及矿化结节计数作为重要观察指标，进行深入探究成骨细胞和分子机制[18]。碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞产生的一种重要酶蛋白，ALP活性表达是成骨细胞增殖、分化能力的特异性指标，其活性高低与成骨细胞分化能力呈明显的正相关,是评价骨形成的最常见指标。骨钙素可以在一定程度上反映成骨细胞活动分化状态，也是体现成骨细胞分化作用的重要指标。阎德文等[19]通过观察补肾填精中药复方对大鼠BMSCs成骨增殖、分化作用的研究结果，发现其可以增加骨钙素的分泌含量，推动ALP的表达活性情况，增强BMSCs向成骨细胞分化、成熟的能力。矿化结节计数的高表达作为细胞分化成熟的最后阶段，是成骨功能的形态表现，是骨形成的重要标志。相关研究[20]通过研究不同浓度(5%、10%、20%)的强骨宝方糖尿病模型鼠含药血清促进成骨细胞分化、矿化的影响，进一步探讨其产生影响的最佳时相与量效。发现以20%浓度的含药血清在以灌药3d 或5d、末次灌胃后1 h取得，对体外培养的成骨细胞的分化及矿化功能促进作用最明显。探究桂皮醛对成骨细胞增殖及成骨功能的影响与浓度相关性，通过碱性磷酸酶活性、钙含量的测定及矿化结节的观察等检测五种浓度的桂皮醛对成骨细胞成骨功能的影响。发现较低浓度(16,8 μg/ml-1)的桂皮醛对成骨的增殖无明显的抑制作用，对碱性磷酸酶ALP活力、钙含量以及钙化结节数量有明显的促进作用[21]。相关实验研究从动物水平分析了补肾活血复方对成骨细胞的直接作用，证实其对成骨细胞的增殖、分化及矿化的促进作用，为日后补肾活血复方更好地应用于临床提供了理论依据和实验支持。

3 临床水平研究

临床根据“肾主骨、“肝肾同源”的原理结合中医辨证论治原则选用补肾活血复方治疗骨和骨代谢疾病，主要通过成骨细胞与破骨细胞之间、骨形成和骨吸收方面的作用机制，多靶点、多环节发挥作用。后期实验研究方面，存在有一定的难度，对于其相关作用机制，目前尚不能完全明确。

牛维等[22]认为补益肝肾及活血化瘀等中药可提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,从而达到降低骨内压,刺激细胞代偿性增生作用,能改善关节软骨的退行性变。根据中西医结合治疗原则，临床上对于骨折手术患者，补肾活血复方通常作为首选方剂之一，注重药物用量和配伍原则，达到补肾壮骨、活血通络之效，从而促进机体修复，加速血液循环，实现骨折愈合的目的。现代药理研究指出，益气补肾活血方一方面可以有效分泌成骨细胞生长因子，丰富骨折断段周围毛细血管[23]，使局部血流通畅。另一方面有效改善机体骨代谢状态，提高骨密度，优化关节功能，完善骨生物力学指标，从而进一步促进骨折愈合[24]。

4 展望与不足

近年来,补肾活血中药对成骨细胞的研究方面已经取得了重大进展,不少验方已得到临床验证,相关中药制剂也已通过国家新药审批，充分肯定了其对骨关节相关疾病的治疗效果。大多数研究选择补肾活血中药，采用体内外同步研究的方法，明确了补肾活血方药对成骨细胞的增殖、分化作用的相关机制，从分子生物学角度为临床应用中药预防和治疗骨代谢疾病提供了理论依据[25]。但是补肾活血中药对于成骨细胞领域的研究和应用仍存在不少问题亟待解决，笔者认为未来应加强以下几个方面的研究：①成骨细胞取材、培养困难，加之伦理限制，是其在短时间内无法很好的解决。②与单味中药相比，临床多以补肾活血复方为主，其作用机制和有效成分也更为复杂，今后还需要进行深入探究，以期更好地应用于治疗。③中药血清制备方面，含药血清的处理与保存，血清浓度的调控以及给药的剂量和次数等需要统一规范和标准。④补肾活血中药产生作用的生物学机制和有效成分的具体分析不够全面。须进一步明确调控机制，分析中药有效成分，研究不同细胞因子和信号通路在中药调控成骨细胞分化中的作用。