口蹄疫几种新型疫苗的研究进展

刘萍董金杰（中农威特生物科技股份有限公司甘肃兰州730046）



口蹄疫几种新型疫苗的研究进展

刘萍 董金杰*（中农威特生物科技股份有限公司 甘肃 兰州 730046）

本文就几种有发展前途的新型口蹄疫疫苗的研究情况进行了综述。

1 口蹄疫新型疫苗研发的必要性

（1）口蹄疫灭活疫苗自诞生以来使用70多年，实践证明灭活疫苗可以有效地限制口蹄疫的流行范围。与严格的政府防控结合时，甚至可以根除地方性口蹄疫。口蹄疫在亚洲、非洲、欧洲及美洲的许多国家都有发生，经过20世纪后半叶有效的疫苗预防接种，欧洲大多数国家和美洲部分国家都消灭了口蹄疫。目前除欧盟取消了口蹄疫灭活疫苗免疫接种政策外，南美和亚洲多数国家仍然在使用口蹄疫灭活疫苗预防和控制口蹄疫。（2）相比新型疫苗，口蹄疫灭活疫苗存在免疫效果良好、生产工艺成熟等诸多优点。但是随着实践经验和研究的深入，口蹄疫灭活疫苗的缺点也逐渐被人熟知。①灭活疫苗使用以来，对灭活疫苗的未彻底灭活，造成口蹄疫的暴发；②口蹄疫灭活疫苗生产过程中存在病毒繁殖，以及对实验动物疫苗免疫后的抗病毒攻击试验，这些环节稍有不慎就有可能使病毒扩散从而造成口蹄疫的流行；③口蹄疫病毒基因组非常容易变异，一旦发生变异，使用原来流行毒株制备的疫苗对变异株的保护能力就会下降。基于上述原因，研究新型疫苗势在必行。基因工程技术的发展为新型疫苗的研发提供了思路，目前正在研发的新型疫苗有多。

2 几种比较有潜力的新型疫苗的研究及应用情况

2.1 基因工程亚单位疫苗 （1）基因工程亚单位疫苗是指使用基因工程技术将编码病原微生物抗原表位导入受体菌或者细胞，使其在受体中高效表达抗原，然后制备的一类疫苗。Kleid等将口蹄疫抗原基因导入大肠杆菌成功表达VP1融合蛋白抗原，并用此抗原制备了口蹄疫基因工程亚单位疫苗，在牛和猪体内均能诱导产生中和抗体，从此各国科学家开始广泛使用这种技术研发口蹄疫疫苗。（2）1979年，有学者发现A型口蹄疫病毒空衣壳在豚鼠体内的免疫原性与完整病毒粒子相同，而抗空衣壳血清与抗病毒血清也具有相同的特异性，由此开始了空衣壳的亚单位疫苗研究。近几年，随着真核表达系统的发展，口蹄疫先后用酵母表达系统、昆虫表达系统都得到较好的应用，另外，也有一些转基因植物表达口蹄疫病毒蛋白的报道。

2.2 合成肽疫苗 合成肽疫苗是以口蹄疫病毒抗原表位的蛋白质序列为依据，用人工方法合成多肽并连到大分子载体上作为抗原，加入佐剂制备的一类疫苗。20世纪60、70年代，学者们发现口蹄疫病毒最重要的抗原决定簇位于VP1上。20世纪80年代，学者们开始尝试使用VP1蛋白作为抗原研制疫苗，试验证明VP1蛋白免疫具有一定效果，但还不足以保护动物受口蹄疫强毒攻击。随着核酸测序技术和化学合成肽技术的发展，人们逐步发现VP1上的多个重要的抗原位点，于是用化学方法合成了这些抗原位点氨基酸序列，并做了动物实验，发现140~160肽能刺激豚鼠产生高水平中和抗体，并能保护强毒攻击。近些年来，国内在口蹄疫合成肽疫苗的研究方面取得了很大成绩，2006年，复旦大学联合中国农业科学院兰州兽医研究所等4家单位共同研制的“抗猪O型口蹄疫基因工程疫苗”获得成功，并获得农业部颁发的“一类新兽药证书”。中牧实业股份有限公司与上海申联生物医药公司共同研发了一种将口蹄疫病毒抗原与猪IgG重链恒定区连接，并在大肠杆菌中高效表达的蛋白作为抗原的猪口蹄疫，免疫效果较好。随着使用范围的扩大，人们对合成肽疫苗的重视程度将会增加。

2.3 表位疫苗 抗原表位又叫抗原决定簇，是抗原分子中能够与T细胞表面受体(TCR)、B细胞表面受体(BCR)或抗体分子的抗原结合片段(Fab)发生特异性结合的特殊化学基团，是引起免疫应答的物质基础。表位疫苗是利用基因工程方法体外表达或者人工合成病原微生物的抗原表位。Bittle等合成了口蹄疫病毒O1K株VP1上的7个短肽，将其分别与KLH蛋白偶联后免疫兔子和豚鼠，结果VP1蛋白141~160及200~213位的短肽引起机体产生较强的免疫应答，口蹄疫表位肽疫苗的研究拉开序幕。Zamorano等将口蹄疫VP1蛋白135~144、135~160短肽制成多聚体，免疫动物均能诱导机体产生高的抗体。常惠芸、邵军军等利用基因技术、蛋白表达等相关技术研制了针对猪、牛和羊的口蹄疫病毒多表位重组疫苗，该疫苗无论在试验动物还是本动物，不仅能够诱导机体产生高水平的中和抗体，还能诱导淋巴细胞发生增殖反应，具有良好的免疫效果。曹轶梅、卢曾军等用3个不同谱系O型口蹄疫病毒B细胞表位和通用型细胞表位串联表达，加入聚肌胞佐剂，使免疫猪的强毒攻击保护率明显得到提高。

2.4 核酸疫苗 核酸疫苗也称基因疫苗，是把外源的抗原基因克隆到质粒上，然后将此质粒转入动物体内，是外源基因在动物内表达，产生蛋白抗原，诱导机体产生免疫反应的疫苗。从理论上讲，核酸疫苗成本低，免疫期长，又易于设计和构建，因此被称为免疫学上的第三次革命。最初构建的口蹄疫核酸疫苗包含A12株cDNA全基因组的pWRM质粒，但全基因组在表达时有可能会产生活病毒，因此在之后的研究中通常只构建表达抗原表位的核酸疫苗，而最常用表达的抗原表位仍旧是衣壳蛋白基因P1和非结构蛋白基因2A、3CD串联起来，同时加入心肌炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)，构建核酸疫苗，并注射到猪体内，部分猪可以抵抗口蹄疫强毒的攻击。Shueh等为增强免疫效果将核酸疫苗和亚单位疫苗联合使用，获得了抗强毒攻击的保护力。

2.5 标记疫苗 经口蹄疫灭活免疫后，动物经常出现隐形感染和持续带毒的情况，一般认为灭活疫苗中除去绝大部分非结构蛋白，免疫动物几乎不产生非结构蛋白抗体，而感染动物体内具有非结构蛋白抗体。因此，经常使用检测血清中非结构抗体的方法区分免疫动物中的感染动物。新型疫苗出现后面临与灭活疫苗同样的问题，为了便于在实验室区分疫苗免疫动物和感染动物，近年来出现了一些能够进行鉴别诊断的标记疫苗。口蹄疫标记疫苗，是缺失了病毒某段致病相关基因或优势表位基因的弱毒苗或灭活苗。利用反向遗传操作技术，即可有目的缺失基因，构建标记病毒，同时也可修饰抗原表位基因，拓展病毒抗原谱。在研究标记疫苗的同时，也要研发相应的鉴别诊断技术，只有鉴别诊断成熟的新型疫苗才是标记疫苗。刘在新等已完成口蹄疫O型标记灭活疫苗的实验室研究，进入临床试验阶段。

2.6 病毒样颗粒疫苗 病毒样颗粒是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，没有感染性，其结构与病毒相似，可以通过与病毒相同的途径传递给免疫细胞，并有效地诱导机体产生免疫保护反应。随着基因工程技术的发展，多数病毒衣壳蛋白基因都已经能够在表达系统中有效表达并自我组装，这为病毒样颗粒疫苗的研发提供了便利条件。病毒样颗粒在人用疫苗的研究非常广泛，并已有商品疫苗投入市场，但在兽医疫苗领域开始相关研究时间较短。孙世琪等用大肠杆菌原核表达口蹄疫VP0、VP3和嵌合型VP1在体外组装出嵌合型FLAG外源多肽口蹄疫病毒样颗粒，外源蛋白插入没有影响病毒样颗粒的空间结构，这项研究为口蹄疫病毒样颗粒疫苗的研发奠定基础。郭慧琛等利用泛素化原核系统，研制的VLPs疫苗效力与灭活苗相当，达到了OIE和中国口蹄疫灭活疫苗的标准。周国辉等Asia1口蹄疫的Asia1/YS/CHA/05毒株的感染中能够形成口蹄疫病毒样颗粒，并在病毒传代过程中稳定表达。用这种疫苗免疫小鼠，可诱导高水平中和抗体，并能持续长时间。口蹄疫病毒样颗粒具有活病毒的很多免疫活性，但是没有感染性，稳定性好，不易失活，因此口蹄疫病毒样颗粒疫苗具有广阔的发展前景。

2.7 标记疫苗 近年来，反向遗传学技术为研究病毒基因结构与功能、病毒复制与表达调控机理等提供了有效的方法，与此同时，也为反向遗传疫苗的研究开创了一片新天地。反向遗传疫苗是通过反向遗传技术实现对病毒基因的改造和修饰，获得预期生物特性的毒株，以提高生产性能、抗原匹配性、免疫应答能力和生物安全性等特征。Fowler等将O1BF和C3RES的VP1G-H的130~157位点替换A12毒株相应位点，并制备了单价疫苗、动物实验显示该疫苗能够对牛和猪等抵抗强毒攻击。郑海学等用反向遗传操作技术构建疫苗种毒Re-A/WH/09株并成功研制疫苗，解决了田间毒株产量低、抗原不稳定、不适于作为种毒的难题。将Re-A/WH/09与Asia1型和O型疫苗种毒组合，研制出口蹄疫三价灭活疫苗。该疫苗对各流行毒的PD50均大于9.0，高于OIE推荐的常规疫苗3个PD50紧急免疫接种疫苗大于6个PD50的国际标准。李平花等以以O/HN/93疫苗毒株的感染性克隆为骨架，用猪毒系病毒的部分VP3和VP1基因替换疫苗毒株的相应部分，构建了嵌合的口蹄疫病毒全长cDNA克隆。该嵌合病毒的成功拯救为口蹄疫病毒嵌合疫苗的研制奠定了基础。反向遗传技术虽然有诸多优点，为新疫苗的研发开辟了一条新途径，但它也存在生物安全风险，研究人员在试验设计中应考虑如何避免毒力返强的问题。

本文介绍了近几年研究有一定发展前景的几种新型疫苗。新型疫苗相比灭活疫苗在安全性上更有优势，可根据需要制备同一种病毒多个成分或多价病毒疫苗，而且大幅度降低生产成本等优点，因此新型疫苗是未来的发展方向。但新型疫苗在免疫效果方面还存在诸多问题。随着生物工程技术的进一步发展，新型疫苗存在的问题必定得到解决。

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