LAMP技术在家禽腹泻性疾病检测中的应用

董雯雯 张世栋 王春玲 艾洪新 李新华 潘力 朱伟 李峰*

LAMP技术在家禽腹泻性疾病检测中的应用

董雯雯①张世栋①王春玲①艾洪新①李新华①潘力①朱伟②*李峰①*

（②山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室 山东省农业科学院家禽研究所 山东 济南 250023 ②山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室 山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊）

快速检测致病微生物是控制疾病暴发的有效方法之一。目前，测病原体的传统方法耗时且劳动强度大，并且通常很容易失去最佳控制疾病的机会。因此，迫切需要一种快速检测疾病的方法。环介导等温扩增(LAMP)是近年来新建立的核酸恒温快速扩增技术。它具有高灵敏度，特异性，视觉检测和对仪器的低需求。它具有节省时间和精力等诸多优点，在分子诊断领域具有很大的潜力。目前，LAMP已被广泛用于检测各种动物病原微生物。本文主要综述了LAMP技术在家禽腹泻病原微生物检测中的应用以及LAMP技术的改进和优化，为快速检测家禽肠道疾病提供了参考。

目前，荧光定量、间接免疫荧光等分子生物学技术在家禽病原检测中起着关键作用，但都需要昂贵的仪器设备及一定操作技能。一旦出现疫情，基层养殖场及实验室很难实现对病原的快速检测[1]。针对这一现象，Notomi等[2]于2000年研发出一种新的DNA扩增技术-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LA MP)。该方法在各项指标上优于传统的分子生物学检测技术，且不需要昂贵的仪器设备、简便、快速、灵敏，仅需在引物及BstDNA聚合酶的催化下，等温水浴30~ 60min，即可实现靶基因109倍扩增[3]，检测成本较低，适合基层地区开展病原微生物的早期诊断和筛查。目前LAMP的检测对象已经覆盖了核酸、蛋白质、细胞等，展现出非常广阔的应用前景。

1 LAMP技术原理

（1）LAMP技术是在等温(60~65℃)条件下利用BstDNA聚合酶和靶基因4条特异性引物进行反应，最后实现基因的指数型扩增，具有高度灵敏性和特异性。本项技术针对设计的4条特异性引物具有严格的要求，分别为正向内部引物FIP，反向内部引物BIP，正向外部引物F3和反向外部引物B3。这几对引物的特点是能够同时识别目标序列的6个特异性片段，从而赋予LAMP很高的特异性[4]。（2）LAMP反应在BstDNA聚合酶的催化下进行，FIP，F3与模板序列结合，形成循环模板，在F3延伸过程中，FIP产生的延伸链被置换出来，与5’端进行碱基互补配对，形成环状结构。BIP与B3再以此为模板序列，在BstDNA聚合酶的作用下进行下一轮链置换反应，形成哑铃状单链DNA，被置换的链自身形成茎-环结构接着与内引物结合进行扩增和链置换，新合成两倍长度的茎-环结构，最后形成多个重复的环状结构[5]。此外，在反应体系中加入两条环引物可大大缩短检测时间，提高检测效率。

2 LAMP反应产物检测

2.1 电泳检测法

LAMP反应产物为多个不同长度的茎-环结构DNA混合物，可通过琼脂糖凝胶电泳方法进行鉴定。结束反应后，取10μl产物，加入荧光染料进行电泳，最后用紫外凝胶成像系统进行分析。对阳性样品进行电泳呈现阶梯状目的条带。

2.2 浊度检测法

（1）由于LAMP反应放大效率高，反应过程中可消耗大量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，dNTPs被消耗使用后则产生大量的焦磷酸根离子，该离子会与溶液中Mg2+结合而产生焦磷酸镁，而使反应液呈现白色。因此，经肉眼观察反应液的浑浊度也可以作为一种判定标准。（2）还可以用浊度仪在400nm波长下检测反应是否发生，并且可以对产物进行实时定量检测[6]，简单快捷。与实时荧光定量PCR仪相比，浊度仪价格便宜，是比较常用的检测工具。

2.3 荧光检测法

LAMP反应产物还可以通过加入SYBR Green I、钙黄绿素等荧光染料/金属离子指示剂进行判断。SYBRGreenI在游离状态下通常显示微弱荧光，当与双链DNA结合后荧光强度增强，LAMP阳性反应过程中在SYBR Green I 指示下反应液由原色橘黄色转为阳性绿色。钙黄绿素则是另一种LAMP荧光指示剂，在阴性反应下，钙黄绿素会与反应液中加入的锰离子结合，荧光消失。阳性反应中产生的焦磷酸根离子与锰离子结合，释放钙黄绿素，钙黄绿素再与溶液中镁离子结合，荧光增强。此种检测方法简单便捷，整个反应过程不需要开盖即可进行结果判断，避免交叉污染。

3 LAMP技术在致家禽腹泻疾病检测的应用

3.1 家禽细菌性腹泻疾病检测

3.1.1 禽致病性大肠杆菌的检测 禽致病性大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌引起各日龄禽类多种病的总称，该病易引起混合感染，造成极大经济损失。梁玉林等[7]针对大肠杆菌O157保守序列rfb E设计两对特异性引物，通过引物筛选和反应条件优化，建立了检测大肠杆菌的反转录环介导等温扩增(Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification RT-LAMP)方法。对比PCR方法结果显示，RT-LAMP方法在等温65℃条件下，30min内能完成扩增反应，所建立的RT-LAMP方法具有较强的特异性。同时该方法灵敏度能达到20 CFU/g，高出PCR方法10倍。

3.1.2 沙门氏菌的检测 沙门氏菌病是一种常见的重要人畜共患病原菌，严重危害家禽肠道健康，本病发病率高，造成严重经济损失。李迎晓等[8]建立了一种沙门菌LAMP检测方法，依据GenBank公布的沙门菌属fimY基因序列，设计特异性引物，优化LAMP反应条件，并对其特异性和敏感性进行了评价。结果表明，LAMP方法具有较强的特异性，最低可检出浓度为56×102CFU/ml，灵敏度高于PCR方法10倍。王瑾等[9]根据沙门氏菌inv A基因保守序列设计特异性引物，利用Midori Green新型核酸荧光染料，建立了沙门氏菌实时荧光环介导等温扩增技术(reahime fluorescence LAMP，RTF-LAMP)检测方法，检测过程仅需45min，灵敏度达6CFU/管，其灵敏性和准确性与国标检测方法相当，但检测时间可缩短至7h。

3.1.3 金黄色葡萄球菌的检测 葡萄球菌是由金黄色葡萄球菌等感染引起的人畜共患传染病，目前已产生多数耐药性，因此快速、准确检测耐药性细菌对于预防此类细菌感染具有重要意义。张涛涛等[10]根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc中的保守序列设计特异性引物，建立并优化反应条件。结果表明，在环引物的作用下，LAMP反应体系于60℃反应35min即可完成扩增，未加环引物下则需45min才能看到白色絮状沉淀。对保存到的其他菌株进行同步检测，发现对2株金黄色葡萄球菌均显示阳性，其他菌株显示阴性，LAMP检测最低检测限为100 fg，低于PCR最低检测限2个数量级。

3.1.4 巴氏杆菌的检测 禽巴氏杆菌病又称禽霍乱，该病主要引起多种家禽、野禽发热、腹泻、呼吸困难，发病率及死亡率较高，目前尚无良好的治疗方法，严重损害养鸡业的经济效益。为建立同时检测大肠杆菌、禽源多杀性巴氏杆菌和鸭疫里默氏菌等水禽常见病原菌的环介导间接PCR方法，程等人[11]根据大肠杆菌的gapA基因、禽源多杀性巴氏杆菌的KMT1基因、鸭疫里默氏菌的OmpA基因序列，分别设计引物、标记至猪线粒体基因片段的两端，制备不同细菌的捕获探针，将捕获探针与待检测菌的基因组杂交、补平缺口、环化。采用1对引物反向扩增捕获探针，建立检测水禽3种常见病原菌的环介导间接PCR方法，特异性检测中沙门菌、金黄色葡萄球菌、小鹅瘟病毒的检测结果为阴性。该方法能检测出100pg的细菌基因组DNA，与常规PCR的符合性为100%。

3.1.5 鸭疫里默氏杆菌的检测 鸭疫里默氏杆菌是鸭产业中最有害的传染性病原体之一[12]，感染鸭群主要表现为眼和鼻分泌物增多、喘气、下痢等。陈红梅等[13]利用RA ompA蛋白基因保守序列设计并合成两对LAMP特异性引物，通过优化反应条件，验证得到在65℃孵育80min，即可达到扩增效果，本方法对大肠杆菌、沙门氏菌等检测均为阴性，灵敏性试验发现该方法对RA ompA最低检测限度为800fg。Han等[14]针对RA GroEL基因保守片段，设计了3对LAMP特异性引物，建立了一种适用于RA多种基因型的LAMP检测方法。该方法能在65℃恒温下，20min内即可实现对目的核酸的扩增，可以检测出细菌量的最低限度为l0CFU，其灵敏度为普通PCR50倍。

3.2 家禽DNA病毒性腹泻疾病检测

3.2.1 禽腺病毒的检测 禽腺病毒(FAdV)在临床上主要为包涵体感染，继而出现呼吸道感染、出血性肠炎，及产蛋量降低，造成一定经济损失。白元斌[15]根据GenBank已公布禽腺病毒血清4型(FAdV-4)Hexon基因序列设计两对LAMP引物，优化反应体系为61℃，反应30 min。与普通PCR检测相比LAMP方法具有更高的灵敏度，检测下限为6.4fg/μl。对采集的临床发病鸡21份肝脏样品进行检测，常规PCR检出率19%，LAMP检出率26%。Zhai等[16]研究出用于检测FAdV-4的循环介导等温扩增耦合与侧向流量试纸(LAMP-LFD)，优化的LAMP-LFD可在65℃下60 min内完成反应，与其他方法比较发现LAMP-LFD可以应用于FAdV-4的诊断，特别是在资源有限的地区。

3.2.2 鸭瘟病毒的检测 鸭瘟病毒(DPV)引起多种禽类的一种急性、热性、败血性传染病，该病流行广泛，发病率和死亡率高[17]。马丽丽等[18]设计3对LAMP特异性引物扩增DPV UL6保守序列，灵敏性试验发现本方法可检测0.1fg核酸，对其他病原体检测均为阴性，优化试验得出该体系在水浴锅中1h内即可完成反应。张坤等[19]人根据DPV基因组序列，设计3对LAMP特异性引物，优化筛选发现该引物在63℃恒温反应1h即可实现目的核酸的鉴定，此外，该检测方法可在反应产物中加入SYBRGreenI染料即可实现眼观判断，该方法敏感性可达0.245μg/L，高于普通PCR近10倍，对其他病毒无交叉反应，对40份临床样品阳性检出率高达30%。本方法检测手段简便快捷，适用于基层实验室快速、准确检测DPV。

3.2.3 番鸭细小病毒的检测 番鸭细小病毒(MPV)可引起3周龄内雏番鸭腹泻等，病死率可达40%~50%以上，是目前番鸭饲养业中危害最严重的传染病之一[20]。孟婷等[21]根据GenBank中公布的MDPVVP3保守序列设计LAMP特异性引物，通过优化反应条件，最终确定该方法在63℃恒温反应1h即可完成高效反应，此外该方法针对核酸的最低检测限为1×10-2ng/μl，且与其他病原微生物不发生反应。该方法的建立为研制番鸭细小病毒的LAMP快速检测试剂盒奠定了基础。

3.3 家禽RNA病毒性腹泻疾病检测

3.3.1 新城疫病毒的检测 新城疫(ND)是我国重点防控的重大动物疾病之一，针对此类病毒已经建立多种实验室检测方法，但是依然存在耗能大，耗时长，需要昂贵设备及专业人员操作等诸多弊端，限制在基层部门的推广。郑鸣等[22]针对AIV HA基因和NDV F基因设计特异性探针，建立了AIV和NDV双重环介导间接PCR检测方法，该方法特异性高，对AIV和NDV核酸样品检测的最低极限质量浓度分别为25.0，12.5μg/L。钱科等[23]选取NDV融合蛋白基因(F 基因)设计了2对特异性引物，对甜菜碱浓度、Mg2+浓度、反应温度等LAMP反应体系的最佳反应条件及特异性、敏感性等进行研究，建立了一种特异性检测NDV的LAMP方法，该方法最低能检测到10个拷贝数的病毒核酸，且向反应产物中加入SYBR GreenⅠ可直接观察样品是否含有NDV。

3.3.2 禽流感病毒的检测 禽流感(AI)是近几年来危害家禽健康的重要疾病，针对该病毒的检测主要有常规PCR、血凝血抑实验，耗时较长。黄书林等[24]针对H5亚型HA基因8个保守区域设计了3对扩增引物，在63℃反应1h，可检出102拷贝的目的基因，比RT-PCR方法敏感约10倍。另外对AIV、NDV和传染性支气管炎病毒检测为阴性。临床验证表明RT-LAMP方法阳性检出率高于RT-PCR方法。Nakauchi等[25]利用RT-LAMP技术检测禽流感A(H7N9)病毒，测定显示其他亚型流感病毒没有交叉反应性；灵敏度试验验证RT-LAMP可测定42.47拷贝数；该检测方法具有高特异性和灵敏度，是一种很有应用前景的禽流感A(H7N9)病毒快速诊断工具。

3.3.3 鸭坦布苏病毒的检测 鸭坦布苏病毒病(DTMUVD)致蛋鸭产蛋率大幅下降，该病较易误诊，因此建立快速高效检测方法尤为重要。Tank等[26]针对DTMUV NSS基因序列设计特异性引物，并在反应体系添加尿嘧啶DNA糖基化酶，建立了UDC-rRT-LAMP检测方法。通过对81份临床样品进行比对试验发现，UDC-rRT-LAMP方法和RT-PCR方法的一致性达到96.88%。吴植等[27]根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列设计了1套引物，通过优化反应，建立了RT-LAMP扩增方法。结果显示，该方法灵敏度是常规RT-PCR100倍，对其他常见禽源病毒无特异性扩增。

4 LAMP技术改进与优化

目前，LAMP已经成功用于临床检测，为进一步提高检测技术的灵敏及准确度，仍需对LAMP技术进行完善更新。以LAMP为基础的多项应用技术已经被大量开发。

4.1 多重LAMP

与普通多重PCR相似，多重LAMP针对多个病原微生物设计2/3对特异性引物，以达到一次扩增反应即可同时鉴定出多重病原微生物的目的，大大提高病检效率。Stratakos等[28]成功设计针对非致病性与毒素大肠杆菌多重LAMP引物，特异性结果显示良好。Rui等[29]针对四种按蚊和两种疟原虫保守基因，通过新开发的DNA提取方法实现目标DNA的制备，同时建立多重LAMP方法，该方法灵敏度大于95%，特异性达100%。

4.2 横向流动试纸条

2008年Kiatpathomchai[30]首次将横向流动试纸条技术与LAMP技术结合(LAMP-LFD)，用于病原快速检测。反应中，FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，与胶体金标记的抗FITC的抗体结合形成三元复合物，并结合在横向流动试纸条具有生物素抗体的检测线上，未杂交的FITC标记探针与胶体金标记的抗FITC的抗体形成不含生物素的两元复合物，通过检测线，结合在控制线上。最后通过检测带即可判断扩增产物的有无。目前该项技术已经应用于弓形虫[31]，沙门氏菌[32]等，该技术实现安全、快速、高效、无需设备及检测人员技术限制，具有广阔的应用前景。

4.3 LAMP-ELISA

将LAMP与ELISA技术联合应用，通过酶联反应产物吸光值的差异，反应扩增目的基因的数值，该方法可增强扩增结果的可靠性及准确性。Lee[33]等将LAMP与ELISA联合检测结核分枝杆菌分离株的多药耐药性。该方法对靶抗药基因热点区域的点突变设计引物，采用LAMP、杂交和热熔法鉴别同源双链DNA(药物敏感染色体)和异源双链DNA(抗体突变体)。以ELISA比色检测，在药物敏感菌株中产生颜色变化。该LAMP-PCR-杂交-热熔-ELISA(LAMP-TM-ELISA)方法与自动BACTEC MGIT 960系统的比较显示该分子分析对异烟肼，利福平，阿米卡星和环丙沙星耐药性的敏感性，结核病分别为92.3%，95.3%，93.1%和91.4%。该方法对检测人员的健康不构成威胁，值得推广应用。

4.4 数字联合技术

数字微流体是目前分子诊断领域新型平台，与LAMP技术结合使该技术得到突破性发展[34]。夏赟[35]首先建立了一种半封闭式的微流控旋转反应芯片平台，并将其成功应用于可视化LAMP检测中。随后，基于泊松统计及化学计量学基本理论，建立了数字等温扩增定量检测方法的数学模型，利用科学计算与可视化工具对该模型进行了蒙特卡洛模拟分析并验证了计算方法的有效及可靠性。该芯片方法能有效跨越4个数量级浓度的病原菌基因组进行核酸定量分析，结果与实时荧光定量结果一致。孔文等[36]整合LAMP和微流控芯片技术，建立微流控RT-LAMP快速检测方法，针对甲型H1N1流感病毒的M基因序列中8个不同区段设计LAMP引物筛选出1套引物，所建立的检测方法可实现扩增结果的荧光实时判读，可在65℃ 30min内完成扩增反应，检测限可达10copies/μl。

5 LAMP展望

LAMP是一项极具实用且高突破性的快速核酸诊断技术。相比于传统检测方法，LAMP操作简单，便捷，不需要昂贵PCR仪，极大缩短检测时间，适用于在条件有限地区的推广应用，LAMP方法已被成功用于细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原的分子生物学检测和诊断。此外，以LAMP为基础的多重LAMP技术、LAMP-ELISA、LAMP与数字核酸技术联合、纳米金-LAMP等不断被开发利用，针对LAMP检测试剂盒也已经用于出售及专利申请，为该技术的普及和推广提供一定的技术支持，目前，LAMP技术已经实现产品化。但LAMP技术也存在假阳性、引物要求高、结果判断单一等不足，目前针对此类缺陷，各研究学者正努力在不断开发新LAMP-LFD技术，Primer Explorer引物设计软件等方面进行突破。相信在未来，随着科学研究的不断深厚，LAMP检测技术将会作为逐步渗入至基层养殖场，极具推广应用前景。

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（2019–09–24）

山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室开放课题（SDPDI201808）

S858.3

B

1007-1733(2019)12-0092-05