神经干细胞疗法治疗缺血性卒中的研究进展

王凌飞

（天津中医药大学第一附属医院针灸部，天津 300193）

我国卒中发病率约为每年274/10万人，其中69.6%属于缺血性卒中（脑梗死）［1］，是老年人致残、致死的首要原因。虽然脑梗死的发病率很高，但其有效的治疗方法却非常局限，目前仅限于机械取栓和静脉溶栓，以再通血管、恢复血流、降低神经缺血损伤。然而机械取栓的技术与设备尚待进一步成熟；而溶栓的治疗因时间窗短、血管再通率低、出血转化风险高等特点也限制了其应用范围。因此，扩大溶栓药物如阿替普酶（rt-PA）治疗窗、减轻副作用的治疗措施可使更多的脑梗死患者获益。

近年来研究显示，神经干细胞（NSCs）具有多效性，对亚急性期和恢复期脑梗死均有治疗作用。NSCs通过替代受损神经元［2］或通过分泌神经营养因子和抗炎因子等“旁观者效应”来保护神经细胞、抑制微环境的细胞毒性成分而促进神经功能的修复［3］。越来越多的临床前研究表明，NSCs移植是一种有效的治疗脑梗死的方法，通过减轻血脑屏障（BBB）渗漏、减轻神经炎症、促进神经发生和血管生成等多种机制发挥促进神经功能恢复的作用［4］。但是在疾病的不同阶段和不同的给药途径，NSCs移植的治疗效果也有所不同。本文即综述NSCs移植治疗脑梗死的效果及存在问题。

1 NSCs简介

NSCs具有自我更新和多向分化潜能，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在哺乳动物脑内，神经发生只出现在特定脑区，包括海马齿状回的颗粒下层、侧脑室的室管膜下区和小脑的外生发层。小脑一旦发育完成，其外生发层在啮齿类动物出生后3周和人类2岁时就会消失［5］。啮齿类动物侧脑室室管膜下区中的神经祖细胞在整个生命过程中均有增殖、分化的能力，并迁移至嗅球，成为嗅球中新的功能神经元［6］。但人类和啮齿类动物在成年后神经发生的程度和持续时间等方面存在差异。人类海马［7］和纹状体［8］内的神经发生一直存在。虽然成人侧脑室室管膜下区中存在NSCs，但未发现其向嗅球迁移［9］。

中枢神经系统的损伤能刺激神经发生。缺血等病理性损伤导致脑内NSCs和神经祖细胞增殖、分化和迁移增加。对成人的研究发现，缺血性损伤后靠近侧脑室壁的脑实质及侧脑室室管膜下区中增殖的神经祖细胞增多［10］。但不论啮齿类动物还是人类，成年后的神经发生非常有限［11］，不能提供足够的细胞来修复缺血损伤造成的神经元丢失。因此，移植体外培养的NSCs是促进脑梗死后神经功能修复的有效办法。

2 NSCs移植治疗脑梗死

在脑梗死早期，脑内出现一系列复杂的病理生理学级联反应，导致脑内微环境随时间推移发生着显著的变化，因此NSCs移植的时机决定了其起效的机制。外源性NSCs可通过替换死亡或受损细胞、或通过分泌神经营养因子和抗炎因子等“旁观者效应”来保护神经细胞并促进神经功能的修复。

替代受损神经元和其它脑细胞是外源性NSCs移植治疗脑梗死的主要目标。研究显示，移植的NSCs最终能够与宿主神经元形成有效的突触连接并显示成熟神经元的电生理特性［12］。此外，外源性NSCs的“旁观者效应”在改善脑梗死后神经功能方面更加有效。NSCs通过分泌多种神经营养因子表达，可改变神经元存活微环境，促进神经元存活及加强神经环路的塑性［13-14］。如NSCs可分泌脑源性神经营养因子（BDNF），BDNF可促进卒中后的神经保护、血管生成、神经发生和功能恢复［15］。NSCs还可分泌分子神经营养因子（NTFs），NTFs能维持神经元的生长、存活，并在细胞外基质重塑、细胞生成和增殖等方面发挥重要作用；NTFs还可保护敏感的神经组织免受损伤［16］。血管内皮生长因子（VEGF）是一种重要的神经营养因子，能促进血管生成，并对神经组织产生保护和修复作用；作为内皮细胞的有效促分裂原和存活因子，VEGF能有效抵抗神经缺血损伤。抑制VEGF可导致NSCs介导的神经保护作用显著降低［17］。研究表明，NSCs分泌的VEGF通过激活星形胶质细胞中的PI3K/Akt通路上调谷氨酸转运蛋白1（GLT-1）的表达，以促进缺血性细胞外谷氨酸的去除，从而改善神经缺血损伤并增强神经可塑性［17］。此外，睫状神经营养因子等其他神经生长因子也具有维持神经元生存，在神经损伤后促进神经元存活与再生的作用［18］。

2.1 NSCs移植对脑梗死早期的治疗作用 再灌注损伤、BBB破坏和免疫细胞浸润导致缺血早期神经组织的进一步损伤［19］。目前临床常采用药物治疗（如米诺环素）来减少急性/亚急性神经损伤［20］。研究显示，NSCs移植可降低缺血损伤的严重程度、减少神经细胞死亡，是一种有效的神经保护策略。对大脑中动脉闭塞（MCAO）的小鼠的研究表明，卒中后48 h，NSCs移植后24 h，脑内显示出炎症反应减轻、BBB损伤下降，并且这种改善作用可维持较长时间［13-14，21-25］。

2.1.1 对BBB的保护作用 NSCs早期移植有助于防止缺血再灌注后对BBB的损害。与未处理的MCAO对照组相比，MCAO后24 h将人NSCs移植到小鼠海马，可见NSCs大量迁移至病灶，导致梗死体积缩小，BBB损伤减少［13］；这种快速反应表明NSCs具有抗炎作用。人NSCs移植的小鼠显示小胶质细胞活化减少以及炎症因子如IL-6、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白-1α的表达降低［13］。

外周IgG在缺血损伤后可通过受损BBB渗漏到脑实质中；在缺血再灌注后24 h将人iPSCNSCs移植到啮齿动物卒中模型中，可见脑内IgG水平降低［21］。MMPs（基质金属蛋白酶）能损伤BBB内皮细胞间紧密连接的功能，导致BBB渗漏；卒中后接受NSCs移植的啮齿动物脑中MMPs有所降低［21］。Adjudin具有抑制神经炎症的功能，成年小鼠MCAO后24 h将Adjudin预处理的小鼠胚胎NSCs移植到纹状体中导致梗死体积减少和BBB破坏改善［22］。这些均表明NSCs移植有助于保持BBB的完整性，并防止卒中后进一步的神经损伤［21-22］。已知rt-PA在4.5 h窗口期之外加剧神经细胞死亡和BBB损伤，因此使用NSCs移植来维持BBB的完整性，可扩大rt-PA的治疗窗以使更多卒中患者受益。

2.1.2 对炎症的抑制作用 脑梗死后，不仅外周免疫细胞通过受损的BBB浸润至脑实质，脑内活化的星形胶质细胞和小胶质细胞也分泌炎症因子进一步加剧神经炎症反应。NSCs移植在脑梗死亚急性期可以通过抑制脑内炎症级联反应来改善预后［14，23-24］。NSCs通过下调炎症调节分子如 TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、IL-1β、IL-6和Iba-1等来防止中枢神经系统损伤［14，24］。人 iPSC-NSCs移植可显著降低卒中小鼠缺血核心区及周围半暗带内的活化的小胶质细胞的数量；移植组动物脑内活化的星形胶质细胞水平也较低［25］。同样，NSCs治疗的脑梗死小鼠脑内CD45+和Iba-1+/MHCⅡ免疫细胞数量显著减少［24］。以上结果提示，NSCs可以通过调节细胞外微环境和减少炎症反应来降低缺血损伤。

2.2 NSCs移植对早期脑梗死的改善效果 脑梗死早期进行NSCs移植可调节神经元存活微环境，以发挥神经保护作用。同时，早期NSCs移植也能促进神经修复，在缺血性损伤后的数天乃至数周内都可观察到神经功能的改善。

2.2.1 改善神经功能 将人NSCs在卒中后1 d移植到大鼠脑中，并采用改良神经损伤严重程度评分（mNSS）评估大鼠的神经功能，发现移植后2周大鼠的神经行为学评分有显著改善［26］。MCAO后24 h接受人NSCs移植的小鼠与未移植的卒中对照相比，损伤后48 h其感觉运动、平衡能力及和运动协调能力均已迅速改善，且损伤后1个月中运动功能得以持续改善［13］。提示早期干预对于脑梗死患者功能恢复至关重要。其他研究也证实，MCAO后24 h移植iPSC-NSCs到小鼠脑中可改善长期的神经学结果［21］；将外源性原代 NSCs［13］或 iPSC-NSCs［21］移植到动物的纹状体和皮质，可促进脑梗死动物神经功能恢复［13，21，27］。此外，将 NSCs直接颅内移植到卒中模型动物的海马体内（神经发生正在进行），能促进NSCs快速迁移到受损区域并促进功能修复［13，21］。有条件永生化的NSCs（小鼠NSC系克隆36，MHP36）MCAO后2 d移植能促进小鼠神经功能恢复；进一步评估小鼠神经功能直至MCAO后28 d，可见足部运动功能及运动协调性均明显改善［28］。此外，在亚急性期（MCAO后 3～4 d）进行NSCs移植也导致梗死体积减少和神经功能改善［29］。总之，这些临床前研究表明，在脑卒中亚急性期的NSCs移植显著改善神经功能。

2.2.2 促进血管生成 NSCs移植可通过促进血管生成以帮助神经功能恢复。卒中后人NSCs的早期移植（第1天）促进了大鼠的血管生成；在NSCs移植后第14天，移植大鼠缺血区新生内皮细胞数量增加，提示血管新生增加［26］。缺血皮质早期移植（MCAO后6 h）小鼠NSCs（用IL-6预处理）能促进血管生成，移植后第14天可见血管密度增加［27］。MCAO后 24 h静脉注射人胚胎NSCs，在损伤后28 d发现血管内皮细胞数量及血管生成增加［30］。老年大鼠MCAO后24 h将小鼠胚胎NSCs移植到同侧纹状体中，能够减少梗死体积，其原因与增加VEGF表达和增强血管生成有关［31］。以上提示在卒中早期进行NSCs治疗能够促进血管形成。

2.2.3 神经发生 在卒中早期进行NSCs移植能通过替代受损神经元或通过内源性神经源性反应的增强，而有益于神经功能的恢复［21，30-34］。

MCAO后48 h将外源性人胎儿NSCs植入大鼠同侧纹状体中，可见移植细胞在第6周和第14周分化为成神经细胞和成熟神经元，同时可见来自室管膜下区的成神经细胞增殖和迁移增加［32］。大鼠MCAO后当天即移植人NSCs，可见移植的NSCs分化为成熟神经元，并替代海马中丢失的神经元［33］。大鼠MCAO后24 h静脉移植人NSCs也观察到类似的结果［30］。在MCAO后24 h将小鼠NSCs移植到大鼠的同侧纹状体中也增加了内源性神经发生，并减少了梗死体积［31，34］。值得注意的是，虽然在研究中观察到有限的细胞替代，但NSCs分化成功能性神经元需要较长时间，并且尚无足够证据证明细胞替代对于NSCs介导的神经恢复是至关重要的。有研究表明，卒中后24 h行颅内iPSC-NSCs植入，在移植后30 d植入细胞仍然存活，但绝大多数移植细胞仍然是巢蛋白阳性NSCs，只有少量分化为神经元［21］。因此，受损神经元替代可能不是脑梗死亚急性阶段NSCs移植后产生有益卒中结果的主要因素。

2.3 NSCs移植治疗脑梗死恢复期的效果 目前的临床研究集中于在卒中恢复期给予NSCs移植对于神经保护的作用。在啮齿类动物卒中模型中，炎性细胞因子在MCAO的急性/亚急性期高表达，但随着时间的推移而降低，并在MCAO后12 d恢复到几乎正常的水平［35］。在卒中后7 d给予脑梗死动物模型NSCs移植，可以避免急性/亚急性期缺血再灌注造成的细胞毒性损伤［36］。多个研究表明，NSCs移植通过促进神经发生、介导血管生成等多种机制在脑梗死恢复期中发挥治疗作用。

2.3.1 血管生成 证据表明，在卒中恢复期进行外源性NSCs移植能促进血管生成和新血管形成。新生大鼠脑梗死后7 d将iPSC-NSCs移植到半暗带中，可见在梗死周围区域表达更多VEGF；移植后14 d，血管生成增加［37］。成年裸鼠缺血性脑卒中损伤后第7天行NSCs移植，发现导致新生血管形成与NSCs表达VEGF呈时空对应关系［38］。MCAO后7 d将IL-6预处理的胎鼠NSCs移植到梗死周围皮质中，也发现NSCs通过STAT3介导的 VEGF上调促进血管生成［27］。MCAO后7 d移植过表达SDF-1α的iPSC衍生的NSCs，缺血脑组织中血管新生显著增加［39］。在梗死后第7天静脉注射NSCs的大鼠在梗死后28 d较对照大鼠有明显增加的血管生成，其脑毛细血管中表达更高的VEGF及其受体VEGFR2［40］。上述研究表明，外源性NSCs通过增加血管新生和形成，促进了卒中的恢复；且这种结果与VEGF旁分泌增强相关。

2.3.2 神经发生 脑梗死后神经功能损伤是脑内大量神经细胞死亡的结果。因此，通过神经发生替代丢失的神经细胞是NSCs移植治疗脑梗死恢复期的治疗机制之一。临床前研究表明，移植的NSCs可分化为成熟神经元并与宿主神经元发生功能整合，形成完整的神经环路，使得移植动物的神经功能明显改善［12，37，41-44］。新生大鼠脑梗死后7 d移植iPSC-NSCs，在梗死后21 d可见NSCs已分化成神经元［37］。接受iPSC-NSCs植入的大鼠肢体运动功能恢复的更好［37，45］。MCAO后9 d移植人iPSC衍生的神经上皮样干细胞，能够在大鼠和小鼠的脑中分化成具有电生理活性的成熟神经元；并且在移植后4周，移植细胞接受来自周围内源性神经元的突触输入，扩展其轴突投射，促进了运动功能的恢复［12］。在MCAO后14 d移植人ESC-NSCs可增强幼年和老年大鼠室管膜下区的内源性神经发生［41］。延迟移植人ESC衍生的神经前体细胞能减少梗死体积并改善大鼠的运动功能［42］。MCAO 后 4周，NSCs移植能显著增加脑梗死大鼠脑纹状体中成神经细胞的内源性增殖［43］，并导致剂量相关的神经功能改善［44］。

当然，并非所有移植的NSCs都能够在脑中存活并分化为成熟神经元［46］。MCAO后7 d移植NSCs，虽然移植的NSCs与宿主神经元形成突触连接并显示成熟神经元的电生理特性，但在宿主脑中成功分化和存活的NSCs数量低于预期［12］。也有研究显示，梗死后4～12周，脑中移植的NSCs数量显著减少［14］。

综上所述，如何促进梗死后移植入脑的NSCs分化成功能性神经细胞并长期存活而发挥功能，仍需进一步努力。尽管一些研究已经观察到NSCs移植后可替代原有失能神经元，但目前尚不清楚这种细胞替代机制是否是改善脑梗死结局的主要原因。而移植细胞存活率低与脑梗死恢复期神经功能改善相关的报道也表明，NSCs移植的治疗潜力可能以促进宿主神经发生和血管生成为主。

3 小结

目前，有研究者提出利用NSCs的生物学特性来跨越目前临床治疗脑梗死的一些障碍，如NSCs可与其它干预措施（如rt-PA）配合使用。NSCs具有抗炎、抗细胞凋亡、促血管生成和促神经发生的作用，可改善rt-PA溶栓治疗相关的一些副作用。虽然NSCs移植明显改善了脑梗死动物的神经功能，但仍需积累更多临床前研究资料以推动相关临床试验的开展。此外，还需关注NSCs移植治疗合并其它病症的脑梗死的效果。如糖尿病不仅会增加脑梗死的风险，还会使脑梗死后死亡率增加3～4倍［47］。由于BBB损伤风险加大，糖尿病患者也无法接受rt-PA的治疗［47］。在脑梗死的啮齿类动物模型中，糖尿病小鼠脑梗死后MMP9 mRNA和蛋白活性较对照组增加更快［48］。此外，糖尿病还是一种炎症性疾病，糖尿病患者体内的炎症反应增强；糖尿病小鼠模型体内炎症标志物明显增加［48］。因此，需要更多的治疗方法来治疗合并其它病症的脑梗死。此外，移植NSCs治疗脑梗死还必须解决某些安全问题。例如，一项小鼠MCAO后24 h将iPSCs移植到同侧纹状体的研究发现移植细胞癌变［49］。因此，尽可能减小致癌风险，也是NSCs移植治疗脑梗死需要考虑的重要问题。

目前，临床上正在开展几项关于NSCs移植的人体试验［50-52］。一项针对人NSCs的Ⅰ期临床试验显示NSCs移植治疗没有安全性问题，并取得了一些治疗的进展［51］。期待不久的将来，NSCs移植能让更多的脑梗死患者受益。