耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌流行病学、耐药现状、检测方法及预防的研究进展

刘妍，元小冬，2，乔思佳，张萍淑，2，李佳慧，郑慧

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是条件致病菌，其可导致重症肺炎、败血症等并严重危及患者生命安全。有研究表明，对碳青霉烯酶敏感的KP感染致死率为20%～30%，而对碳青霉烯酶耐药的KP感染致死率为40%～70%［1-2］。近年来随着抗生素广泛使用，临床多重耐药菌不断增加［3］，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）检出率不断升高，耐药性不断增强，且其耐药基因可由质粒介导，通过转化、接合、转导等形式传递，形成多重耐药菌，并可通过水平传播的方式导致流行或暴发，因此KP耐药性问题越来越严重。本文主要综述了CRKP的流行病学、耐药现状、检测方法及预防，以期为临床有效防止CRKP提供参考。

1 流行病学

1997年MACKENZIE等［4］首次报道了CRKP，此后全球多个地区陆续出现了CRKP感染报道［5-7］。目前，世界范围内有CRKP产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）、苯唑西林酶-48（OXA-48）、新德里金属蛋白酶（NDM）等的播散［8］。研究显示，西方国家多见CRKP产KPC-3型，我国多见CRKP产KPC-2型［9-11］。YIGIT等［12］于2001年首次报道美国北卡罗莱纳州医院中存在CRKP产KPC-1型；2007年我国浙江杭州地区发现KP产KPC-2型［13］；史玮炀等［14］收集了上海交通大学医学院附属仁济医院2013年1月—2015年8月感染患者中CRKP共107株，均检出KPC-2基因，提示KPC-2基因可能是CRKP感染的主要基因型。MONARI等［15］选取2014年8月—2015年1月意大利佩鲁贾综合医院不同病房131株KP进行分析，发现至少对一种碳青霉烯类抗菌药物具有耐药性的KP有42株（32.1%），其中41株（97.6%）携带bla KPC基因。王凤等［16］对2013—2017年中国人民解放军总医院内4 946株KP进行分析，发现710株CRKP，占14.4%，其中产KPC的CRKP占82.8%，且医院CRKP比例由2013年的3.2%增至2017年的29.3%。

2 耐药现状及耐药机制

2.1 CRKP耐药现状 随着抗生素广泛使用，KP的耐药性不断增强，特别是对碳青霉烯类抗菌药物，这在很大程度上限制了碳青霉烯类抗菌药物的应用［17］。碳青霉烯类抗菌药物是治疗多重耐药革兰阴性杆菌最有效的抗菌药物，具有对β-内酰胺酶作用稳定、毒性低等优点。近年来KP对碳青霉烯类抗菌药物耐药现象广泛存在，其全球耐药率为20%～70%［18］。我国KP对碳青霉烯类抗菌药物耐药率从2005年的3%上升至2015年的15%，甚至达20%［19］，主要流行于浙江、江苏、上海等地［20］。

OU等［21］收集中国中部医院不同部位分离出的KP 955株，其中117株被鉴定为CRKP，占12.3%；2013—2015年CRKP分离率分别为8.9%、11.3%、16.2%，呈逐年增长趋势，其中超过95%的CRKP对氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、亚胺培南、头孢他啶、哌拉西林等抗菌药物耐药。有研究表明，KP携带的耐药基因中以SHV基因最常见，是KP对氨苄西林产生耐药的主要遗传学基础，而携带qnr类基因的KP更易在患者之间进行传播，进而引发医院感染［22］。针对CRKP耐药现象，临床上应加强对KP基因型检测，对不同基因型KP采取相应有效措施，同时应根据药敏试验结果选用敏感抗生素，尽量避免使用广谱抗生素，以减少KP耐药。

2.2 质粒在CRKP耐药中的作用 质粒是独立于细菌染色体之外能够自我复制的DNA分子，携带耐药基因的质粒能对氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹诺酮类、大环内酯类等多种抗菌药物产生耐药性［23］。研究表明，质粒介导的耐药基因可随插入序列、转座子等移动遗传元件在细菌之间发生水平转移［24］，因此质粒可导致CRKP耐药性的扩散。

2.2.1 质粒耐药机制 1957年AKIBA和OCHICI在试验中发现，具有多重耐药性的大肠埃希菌通过质粒接合并可以将耐药性传递给较为敏感的志贺菌，此后世界各地也陆续报道了耐药质粒的存在及其传播［25］。细菌耐药性的产生机制多为质粒可以通过接合方式传递获得耐药性基因，而基因环境中存在介导转移的基因元件，因此质粒中携带的碳青霉烯酶基因更易于在不同细菌间转移，导致碳青霉烯酶耐药性广泛传播。不同的质粒之间还可以通过杂交方式携带更多外来获得的耐药基因，使其耐药性不断增加［26］，而相同型的质粒更容易在亲缘关系相近菌株之间进行传播［27］。此外，质粒还能通过捕获外源性DNA而使细菌易于定植于新环境，其在细菌不断进化、适应外界环境方面也起着重要的作用［28］。

2.2.2 质粒耐药的流行 2003年GALIM等［29］在法国分离出一株耐氨基糖苷类药物的KP，且相关耐药基因可通过细菌质粒接合试验传播到其他菌株内。2009年，美国广泛流行的CRKP产KPC中以碳青霉烯抗性肺炎克雷伯菌克隆序列258型（ST258）为主，且大量携带此基因的质粒是导致bla-KPC基因快速传播的主要原因［30］。在以色列KP ST258菌株提取的不相容群Ⅱ型（IncF Ⅱ）质粒中发现KPC-3基因［31］，说明质粒在CRKP水平传播与流行中起着重要作用。刘艳梅等［32］分析2015年神经重症监护室患者分离的31株KP发现，其均含有质粒并携带SHV基因，其中质粒中携带1种耐药基因的KP 7株（22.6%），携带2种耐药基因的KP 12株（38.7%），携带3种基因的KP 6株（19.4%），携带4种基因的KP 3株（9.7%），携带5种基因的KP 1株（3.2%），携带6种基因的KP 2株（6.5%），表明质粒中可同时携带多种耐药基因且以SHV基因最常见，而质粒上携带耐药基因种类多也是近年来质粒介导KP耐药性广泛流行的重要原因。

2.2.3 质粒的同源性 以质粒为基础的同源性分析包括质粒图谱和质粒酶切图谱［33］。有研究表明，将一些菌株的质粒消除后，其耐药性会变弱甚至消失，从而阻断细菌耐药性传播［34］，但目前关于KP质粒同源性的研究报道较少，故可通过加强对质粒同源性研究而了解其水平传播特点，以便于临床及时阻断、减少KP耐药。

3 检测方法

脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术作为同源性检测的“金标准”，常与多位点序列分型（MLST）联用研究细菌之间亲缘关系和相关性。近年来全基因组测序（WGS）较为流行，其可以确定细菌耐药基因型、细菌来源、传播途径，对研究CRKP流行及耐药具有重要意义。

3.1 PFGE PFGE的原理是将待测菌块包埋于琼脂块中，用特异性内切酶对细菌染色体进行酶切，由于染色体DNA大小不同，因此其在交替改变的电场中速度也不同，进而呈现出不同条带，最终根据条带数目和位置比较细菌间同源性，完全相同者则为同一型［35］。杨竹兰等［36］报道1例患者分离的CRKP并在该患者周围环境中检出4株KP，采用PFGE对其进行同源性分析结果显示，周围环境中有3株与患者电泳图谱相同，1株与患者电泳图谱相差2条条带，证明患者及其周围环境检出了同一种CRKP，表明患者周围环境是CRKP传播及感染的重要因素，可加强对患者周围环境消毒管理，以减少感染。

3.2 MLST MLST是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，其通过PCR扩增多个管家基因内部片段并测定相应基因序列，进而比较序列之间的差异，分析菌株变异，从而确定菌株之间的相关性［37］，具有操作简单、检测快等优点，并便于在不同实验室间进行比较。陈东科等［38］收集了全国49家医院88株CRKP进行MLST，结果显示，共有25个MLST型，其中ST11有48株（75.0%），源自18个城市32家医院，说明ST11菌株为CRKP优势菌群并在全国范围内广泛流行。

3.3 WGS 基因组包含生物体全部遗传信息，因此WGS能够直接反映基因组DNA遗传信息。研究表明，在确定细菌耐药基因型、预测细菌耐药表型方面，WGS特异度、灵敏度均较高，是一种简便高效的检测手段［39］。WGS不仅能对目前已知的耐药基因簇进行筛选或确定已知耐药基因耐药表型，还能确定潜在或未知的基因簇或预测潜在耐药机制［40-41］。DELEO等［42］对2株CRKP产KPC的ST258型KP与其他8个进行WGS的菌株比较，发现ST258有两种不同遗传分支，对诊断、治疗和预防由多重耐药CRKP引起的感染有重要作用。朱健铭等［43］采用WGS对广泛耐药KP JM45的质粒1（pJM45-1）进行分析发现，pJM45-1携带83个耐药相关编码基因，且与耐药质粒R100有99%的序列相同，与接合性质粒F质粒有87%序列相同，与源自KP的质粒在同一簇，提示KP pJM45-1携带大量耐药元件，是导致KP进化为广泛耐药的主要原因，同时其可导致耐药基因在细菌间进行水平转移，造成耐药菌传播。WGS虽是一种新技术，但其能够较全面地反映细菌耐药性及耐药机制，确定细菌来源及传播途径，为临床上阻断细菌传播、减少耐药提供重要信息。

4 预防

我国CHINET结果显示，临床分离的克雷伯菌在2005—2014年对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率增长幅度较大，但其他抗菌药物的耐药率变化不大，其中亚胺培南耐药率从2.9%上升至10.5%，美罗培南耐药率从2.8%上升至13.4%［44］。近年来，KP耐药率不断上升，导致CRKP广泛传播，给临床治疗带来极大困难，因此采取积极有效的预防措施至关重要。

4.1 抗生素的合理应用 减少细菌耐药的关键是抗生素的合理使用，临床上使用抗生素时要有严格指征，按照细菌培养药敏试验结果选择敏感抗菌药物，尽量避免使用广谱类抗菌药物；还要遵循整疗程原则，加强对使用抗生素的监管，及时发现并纠正不合理用药，以减少抗菌药物滥用。目前，临床针对CRKP多选用多黏菌素、替加环素和氨基糖苷类药物。GHEITANI等［45］于2017在伊朗伊斯法罕收集两家医院100份样本并鉴定产碳青霉烯酶的KP，通过评估黏菌素-美罗培南联合治疗结果发现CRKP 68株，其中21株对使用过的抗菌药物表现出高度抗性，统计学结果显示美罗培南和黏菌素有协同作用，提示临床治疗CRKP时可以加强此类药物应用，并注重联合应用。

4.2 加强感染控制措施 KARAMPATAKIS等［46］通过主动监测计划和常规感染控制措施，记录了耐碳青霉烯类革兰阴性菌发病率、患病率、定植压力、感染和对感染控制措施依从性、增强感染控制措施，通过时间序列和中断时间序列进行分析，结果显示，在主动监测计划中增强感染控制措施使耐碳青霉烯类革兰阴性菌发病率、患病率和定植压力呈下降趋势，其中CRKP感染从每1 000个病床日（IBD）19.6下降至8.1，说明加强感染控制措施，包括增强手部卫生、积极监测、加强预防措施、积极反馈政策和干预措施可以减少流行地区CRKP发生。刘晓翠等［47］对2015年1—10月神经重症监护室空气环境、KP感染患者周围空气和病床单位进行细菌学监测，结果显示，KP能够在神经重症监护室空气环境和患者病床单位环境中定植生存并成为重要感染源，而神经重症监护室空气传播是KP感染的重要传播途径。所以，在临床治疗中要加强对患者的监测，一旦发现CRKP应立即上报，做好病房及患者周围环境的消毒，避免病房内患者间、医护人员与患者间交叉感染，以减少CRKP的流行。

5 小结

近年来，CRKP的临床流行和耐药率呈上升趋势，为减少其传播首先应做好病房环境消毒，减少病房患者间交叉感染，避免医护人员与患者间感染；临床上应根据药敏试验结果选择有效抗菌药物，并尽量避免广谱抗菌药物的使用。质粒携带耐药基因可以在不同细菌间发生水平转移，导致CRKP耐药性增强并易引起暴发和流行，因此临床上应加强对质粒携带耐药基因、质粒介导耐药基因水平转移进行研究，进而阻断CRKP水平传播。可以加强对CRKP质粒同源性的临床研究，通过质粒酶切图谱得到聚类分析图，了解质粒间亲缘关系，分析其流行和传播特点，预见其传播情况，在暴发流行早期及时制止；在暴发流行时可应用WGS以实时了解暴发情况，控制CRKP传播、感染。