DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷检测方法及其临床意义

史华旭，吴子一，陈世奇，刘天依，倪月秋

（1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业学生，辽宁 沈阳 110034；2.生理学教研室）

活性氧（reactive oxgen species，ROS）是需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇，包括超氧自由基（·O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（·OH）等［1］。机体在正常情况下会清除体内多余的活性氧，维持机体氧化还原平衡。一旦该平衡被打破，就会使ROS积聚，引起DNA氧化损伤，导致基因突变、细胞癌变和个体衰老等。8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OH-dG）是ROS攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位C原子结合-OH而产生的一种氧化性加合物，在体内稳定存在，一旦形成，不再被机体进一步代谢，且其生成不受饮食等因素影响，可被特异性DNA修复酶剪切清除，经肾脏随尿液排出［2］。8-OH-dG是目前公认的一种评价DNA氧化损伤和氧化应激状态的生物标志物，对许多疾病的诊断评估具有重要意义［2］。本文对8-OH-dG的检测方法及其与相关疾病如职业暴露疾病、糖尿病肾病、肿瘤、男性不育、心血管疾病、儿童相关疾病等的相关性进行了综述。

1 常用的检测方法

1.1 酶联免疫吸附法（ELISA） ELISA法是应用单克隆抗体检测加合物的技术，是一种半定量的检测方法，具有灵敏度和特异度高、操作简单、重复性好、测定时间短且生物样品不需要预处理、不需要昂贵的仪器等优点，市面上可直接购买到检测8-OH-dG的ELISA试剂。ELISA法是目前临床研究普遍采用的检测方法，可用来检测组织、细胞、尿液和血液中的8-OH-dG。许海棠等［3］用ELISA法检测30例川崎病患儿急性期、30例恢复期、12例正常对照组儿童及12例发热组儿童的血清8-OH-dG水平，结果发现川崎病急性期患儿血清8-OH-dG水平显著高于恢复期、正常对照组和发热组（P＜0.05），ROC曲线分析显示，血清8-OH-d G的诊断界值为57.02 pg/ml，敏感度为90%，特异性为75%，阳性预测值64.3%，阴性预测值93.8%，表明8-OH-dG可作为早期预测川崎病血管损伤的标志物。

1.2 高效液相色谱-电化学法（HPLC-ECD）HPLC-ECD法是将DNA酶水解样品用HPLC分离后用ECD测定，是一种定量检测方法，具有较高的灵敏度，需要的样品量少，检测线性范围宽等特点［2］。HPLC-ECD法可同时检测多种氧化产物，也可直接检测组织细胞DNA、尿液和血液中的8-OH-dG浓度。鲁文红等［4］利用HPLCECD法测定HepG2细胞内8-OH-dG的水平，发现8-OH-d G峰与杂质峰分离良好，8-OH-d G浓度在1～25 ng/ml之间呈良好线性，最低检测浓度为 0.39 ng/ml，表明该方法检测 HepG2 细胞内8-OH-dG 灵敏、准确、重复性好。Shimoi等［5］对ELISA和HPLC-ECD检测8-OH-d G的对比分析发现，120份原始尿液样本用HPLC-ECD检测8-OH-dG 的平均 值 为（4.46±2.03）μg/g肌酐，ELISA 检测8-OH-d G的平均值为（9.33±3.23）μg/g肌酐，ELISA检测值比HPLC-ECD高约2倍，而对HPLC纯化的尿液样品进行检测，两种方法的检测平均值差异无统计学意义，因此，使用ELISA法进行检测时，需要对样品进行预纯化处理，以确定样品中8-OH-dG水平。HPLA-ECD法存在DNA酶解不完全、干扰物质同时被洗出，导致测量值高于真实值的缺点。

1.3 高效毛细管电泳法（HPCE） HPCE是利用8-OH-dG与其他脱氧鸟苷泳动的方向和速度不同而进行分离，通过比较保留时间来定性，外标法定量，分离效率高，较HPLC快，保留时间短［6］。颜流水等［7］利用纳米金在线富集－毛细管电泳法测定尿样中8-OH-dG水平，8-OH-d G与d G在10 min内可实现基线分离，8-OH-d G浓度在0.5～50.0 μmol/L范围内呈线性，检出限为39 nmol/L，所得加标回收率在90.0%～104.6%。

除了上述三种常用的检测方法，气相色谱-质谱法（GC/MS）法、32P后标记法、免疫杂交法等也用来检测8-OH-dG［2］。

2 8-OH-d G与相关疾病

2.1 8-OH-dG与职业暴露 一些职业经常接触镍、铬、汞等金属，长期职业暴露可能会影响工人的身体健康。研究显示，职业性镍接触工人尿中8-OH-d G及尿镍、尿铬均高于对照组，镍、铬接触工人的尿中镍、铬含量与8-OH-dG含量呈正相关（P＜0.05），提示职业性的镍、铬接触对工人产生一定的氧化损伤作用，且镍、铬接触工人的工龄与尿中8-OH-d G及铬、镍含量均呈正相关（P＜0.05），表明职业性镍、铬接触危害程度与镍、铬暴露时间和接触剂量有关［8］。8-OH-dG含量提高是由于镍、铬化合物可引起氧化应激和DNA、蛋白质的氧化损伤［9］。钟丽［10］研究发现，空气中汞浓度与工人尿汞浓度呈正相关（r=0.624，P＜0.01），接触汞者的尿8-OH-dG中位数为3.94μg/g肌酐，显著高于非接触汞者2.60μg/g肌酐，表明接触汞可引起DNA氧化损伤。在焦炭生产工艺过程中产生的焦炉逸散物含有大量致癌性的多环芳烃，其在代谢过程中可产生大量ROS，诱导机体产生氧化应激。王艳华等［11］对低水平焦炉逸散物接触与焦炉作业工人尿中8-OH-dG的剂量-效应关系进行研究，发现接触组人群尿中8-OH-dG水平高于对照组（P＜0.01），且焦炉逸散物接触水平与尿中8-OH-d G水平呈剂量-效应关系。焦炉逸散物已被国际癌症组织列为确认人类致癌物，焦炉工肺癌亦已被列为我国法定职业性肿瘤［12］。此外，高艺等［13］研究发现，汽车制造厂工人长期低浓度苯系物暴露可引起人体内自由基清除能力下降，引起机体氧化应激损伤，表现为暴露组血清中氧化应激损伤产物丙二醛（MDA）和8-OH-dG浓度显著高于非暴露组（P＜0.05）。上述重金属对人体的危害不容小觑，8-OH-d G的含量在一定程度上可以提示身体健康状况，并有望成为职业病体检指标。

2.2 8-OH-dG与糖尿病肾病 糖尿病肾病是糖尿病常见的并发症之一，也是终末期导致肾功能衰竭的主要原因。目前我国糖尿病肾病患病率已经超过慢性肾小球肾炎，成为城市居民慢性肾病的重要病因［14］，但该病起病隐匿，故其早期诊断尤为重要。在高血糖状态下，细胞内氧化应激加剧，导致8-OH-d G增加，其中尿8-OH-d G增加与糖尿病并发症严重程度相一致［15］。吴孟水等［16］通过观察不同时期糖尿病肾病患者血清8-OH-dG的水平发现，2型糖尿病患者8-OH-dG浓度显著高于健康对照组，而糖尿病肾病患者8-OH-dG浓度显著高于单纯2型糖尿病患者（P＜0.01），Logistic回归分析显示8-OH-dG 是糖尿病肾病发生的独立危险因素，表明血清8-OH-d G水平可以反映糖尿病肾病严重程度。Waris等［17］研究发现，与健康对照组相比，2型糖尿病患者血浆8-OH-d G浓度增加2倍，尿中8-OH-dG浓度增加28倍；2型糖尿病患者中，肾病与血浆8-OH-d G增加有关。因此8-OH-d G有望成为糖尿病肾病的早期诊断指标。

2.3 8-OH-dG与肿瘤 8-OH-dG能够引起碱基配对错误，从而导致基因突变，进而诱发癌变。8-OH-d G的表达与肿瘤的发生发展密切相关［18］。彭昭等［19］用HPLC法测定8-OH-dG在胃癌及癌周组织的含量，发现8-OH-dG水平在胃癌组织中明显上调，与胃癌组织分化程度、临床分期相关。刘志勇等［20］检测了173例乳腺癌患者血清和150例乳腺癌患者癌组织中8-OH-dG的表达水平，并以HPLC-ECD法测定尿液中8-OH-dG水平，发现血清中8-OH-dG水平与组织中8-OH-d G水平的表达呈正相关（r=0.163，P＜0.05）；在乳腺癌患者中，淋巴管及淋巴结转移患者的血清8-OH-dG水平较低；8-OH-dG免疫组化染色阴性患者生存率更低（P＜0.01）；乳腺癌患者尿液中8-OH-d G浓度显著高于健康妇女（P＜0.01），结果表明血清及癌组织中8-OH-d G低表达与乳腺癌的浸润性相关，8-OH-dG染色阴性可能是乳腺癌患者的一个独立预后因子，利用尿中8-OH-d G浓度可预测乳腺癌所产生的DNA损害，对乳腺癌产生的人体早期危害提供良好的生物指标。唐毅等［21］利用ELISA法检测了100例肝癌患者的尿8-OH-dG水平，发现肝癌患者尿8-OH-d G水平显著高于健康人群，表明DNA氧化损伤与肝癌发生发展具有密切的关系，测定尿8-OH-dG水平有助于肝癌的诊治。徐兴农等［22］利用HPLC法检测31例肺癌患者术前尿液样本和术后样本的8-OH-d G水平，发现肺癌术前组的尿液8-OH-dG水平显著高于肺癌术后人群和健康人群，表明尿液8-OH-dG的含量检测对于肺癌的诊断具有特异性，在肺癌的治疗效果评估方面具有一定的实用价值。Pylväs-Eerola等［23］利用ELISA法测定上皮样卵巢癌（EOC）患者血清8-OH-dG水平，发现血清8-OH-dG水平高与较差的总生存期（OS）（P=0.019），较差的无病生存期（DFS）（P=0.020），铂耐药性（P=0.002）相关，特别是在子宫内膜样EOC组中，患者血清8-OH-dG 水平与较差 DFS（P=0.005）和铂耐药性（P=0.007）显著相关，表明血清8-OH-dG水平升高是EOC患者预后不良的重要预测因子。

以上研究结果表明，8-OH-dG可作为一种肿瘤标志物来反映因癌变而产生的DNA氧化损伤程度，通过测定机体8-OH-dG含量，可对与氧化应激损伤相关疾病进行早期监测与预后评估。

2.4 8-OH-dG与男性不育 甄锦壮等［24］研究发现，导致不明原因复发性流产的男性不育患者精浆MDA和8-OH-dG浓度显著升高（P＜0.01），表明患者存在精子DNA氧化损伤，8-OH-d G可对精子DNA氧化损伤准确评价，是抗氧化治疗的依据。

2.5 8-OH-dG与心血管疾病 Di Minno等［25］对8-OH-d G水平与心血管疾病之间的关系进行了Meta分析，纳入14个研究，包括810例心血管疾病患者和1 106例对照组，发现心血管疾病患者的8-OH-dG水平显著高于对照组（SMD：1.04，95%CI：1.04～1.47，P＜0.01），年龄、高血压和男性性别显著影响8-OH-dG水平。靳钰［26］研究发现，缺血性心肌病患者的血清8-OH-d G水平显著高于正常对照组。吴文翔［27］研究发现，冠心病合并阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）患者血清8-OH-dG水平显著升高，提示患者的氧化应激反应偏高，检测血清8-OH-dG水平对其有一定的临床预警作用。

2.6 8-OH-d G与儿童相关疾病 缺血缺氧性脑病（HIE）是各种原因引起的脑组织缺血缺氧导致的脑部病变，最常见的是新生儿HIE。胎儿宫内窘迫，如脐带绕颈、羊水异常等，可导致新生儿HIE，其严重时可产生严重后遗症。李晓梅等［28］研究发现，HIE患儿出生后第3天血清8-OH-dG水平明显高于出生后第1、7天，相同时间点HIE患儿血清8-OH-dG水平明显高于对照组，血清8-OH-d G水平与HIE严重程度相关，重度HIE患儿的8-OH-dG水平最高，表明8-OH-dG水平可作为判断新生儿是否发生HIE的指标。早产儿脑损伤发病机制尚不完全清楚，围产期窒息、缺氧、缺血和宫内感染等有关，氧化应激损伤是重要发病机制之一。刘海霞［29］以脑损伤早产儿为研究对象，观察8-OH-dG在脑损伤早产儿血液的表达变化情况，发现脑损伤患者血和尿8-OH-d G表达水平显著高于对照组，表明血和尿8-OH-dG是诊断早产儿脑损伤的早期指标，并推测氧化应激损伤（DNA氧化损伤）可能是早产儿脑损伤的发病机制之一。侯小霞［30］研究发现，7～8岁组儿童尿液8-OH-d G水平显著高于3～4岁组儿童（P＜0.05），表明高年龄儿童处于一个较高的氧化应激水平，并可能对儿童生长发育造成影响。前文提到的DNA氧化损伤与肝癌发生发展具有密切的关系，及某些重金属暴露会引起机体氧化损伤，这两点在儿童相关疾病上也有体现，8-OH-dG水平可作为评价儿童罹患肝癌风险、儿童慢性铅暴露等儿童相关疾病的发病风险的标志物［31］。