香烟烟雾对卵巢颗粒细胞的影响*

周洋 章帆 徐湛湛 孙琦 应居正 徐营

(嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001)

在生活中人类接触香烟烟雾的机会巨大，据报道，香烟烟雾中有超过5000种的化合物，已经确定的致癌化合物多达60种，主要包括多环芳烃(如苯并芘)、亚硝胺和芳香胺等[1]。有研究表明，香烟烟雾中的这些有害物质可引起颗粒细胞中一些基因表达的变化，使卵巢内颗粒细胞发生凋亡，并且凋亡的发生与线粒体的功能变化密切相关。

1 香烟烟雾对女性生殖影响的现状

尽管目前全球成年女性吸烟人数低于男性，但多数国家女性吸烟人数表现出上升趋势，即使不吸烟，女性暴露于香烟烟雾的危险亦不容忽视。我国女性被动吸烟人数巨大，大多数女性都有不同程度香烟烟雾接触史，且人数远高于发达国家水平[2]。有流行病学研究显示长期暴露于香烟烟雾中，女性的卵巢结构和功能会发生变化，生殖能力会受到影响。Mohammad等对此进行了研究，证明了香烟烟雾暴露能够对女性生殖能力造成损伤[3]。香烟中含有焦油、烟碱、CO、醛类等有害的物质，可通过氧化等机制对女性卵巢产生伤害。有研究将关注点聚焦于颗粒细胞，发现这些有害物质使卵泡中颗粒细胞的自噬小体增加，颗粒细胞自噬作用增强，导致卵泡数量减少，卵泡成熟率降低，进而卵巢质量下降，影响女性生殖能力[3]。

2 香烟烟雾对卵巢颗粒细胞和卵母细胞间作用的影响

卵母细胞由卵原细胞发育而来，出生后的女性卵巢卵母细胞经历了初级卵母细胞和次级卵母细胞阶段，其发生与发育的基本单位为卵泡。在正常生理功能下，颗粒细胞和卵母细胞处于同一个微环境中，颗粒细胞由卵泡细胞发育而来，且随着卵母细胞发育，颗粒细胞能够分化出卵丘细胞和颗粒细胞，卵母细胞在两种细胞作用下发育生长[4]。卵丘细胞主要起着支持卵母细胞发育的作用，并提供能量给卵母细胞。同时，卵丘细胞还参与调控了卵泡成熟的变化过程。颗粒细胞能够分泌促卵泡刺激素(Follicule-stimulating hormone，FSH)受体和黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)受体等多种激素受体，同样能够作用于卵母细胞。不仅如此，颗粒细胞和卵母细胞间存在着旁分泌和间隙连接[5]，在生理情况下，两者相互影响。香烟烟雾中含有醛类等有害物质，能活化颗粒细胞内多种酶，产生内源性ROS，而使颗粒细胞内氧化增强，造成线粒体在氧化作用下损伤[6]。线粒体产能减少，获得能量不足，使颗粒细胞功能受损。香烟烟雾亦能通过影响mfn1/2和PARKIN表达破坏线粒体。在香烟烟雾提取物作用下mfn1/2表达下降，线粒体融合障碍，线粒体功能结构破坏[7]；PARKIN表达升高，主要通过增强自噬作用使线粒体和颗粒细胞受损[8]。

同时颗粒细胞能够产生生长因子，通过颗粒细胞和卵母细胞间的细胞连接，将其包含的信息传递给卵母细胞。当颗粒细胞功能受损，颗粒细胞产生的生长因子减少，对卵母细胞作用减弱，颗粒细胞传递给卵母细胞的信息减少[9]，使卵母细胞发育和功能下降，从而对女性的生育功能产生影响。香烟烟雾水溶物亦能直接影响颗粒细胞和卵母细胞间的细胞连接。长期暴露于香烟烟雾水溶物中，香烟中的尼古丁等成分可以进入颗粒细胞和卵母细胞的细胞连接中，同样使颗粒细胞与卵母细胞信息传递减少，造成卵母细胞发育受到抑制和卵泡细胞减数分裂混乱[10]。

3 香烟烟雾对颗粒细胞生长因子表达的影响

正常情况下，颗粒细胞能分泌相关因子如抑制素(Inhibin，INH)、雌二醇(Estradiol，E2)、胰岛素样生长因子(Insulin like growth factor，IGF)等，对卵泡生长和发育起调节作用。香烟烟雾水溶物通过氧化损伤和影响PINK1/PARKIN和mfn1/2基因的表达，造成颗粒细胞功能下降，颗粒细胞表达产生的INH、E2和IGF减少，使卵母细胞发育受影响，从而使生殖能力下降。

香烟烟雾水溶物使颗粒细胞中抑制素α亚基基因表达产生的INH减少，通过负反馈抑制使FSH分泌下降。同时在卵巢上存在激活素受体，抑制素在多糖的作用下，通过细胞表面的TGF-β超家族与激活素相互作用，与激活素竞争结合激活素受体，使激活素的活化作用减弱。由于在正常卵巢中，激活素能够促进下丘脑释放促性腺激素释放激素，垂体促卵泡激素生成，当激活素活化受抑制，FSH合成减少。香烟烟雾水溶物通过影响FSH合成，使卵泡的发育受阻[11]。

雌二醇(Estradiol，E2)能促进颗粒细胞卵泡刺激素受体的表达，同时抑制颗粒细胞凋亡。香烟烟雾水溶物使雌二醇产生减少，雌二醇的作用靶点之一为颗粒细胞，其使颗粒细胞细胞膜上卵泡刺激素受体的表达减少，抑制颗粒细胞凋亡作用减弱，造成颗粒细胞凋亡[12]。

胰岛素样生长因子(Insulin like growth factor，IGF)能促进细胞存活和增殖，亦能使细胞凋亡能力减弱。在窦前卵泡和窦卵泡的颗粒细胞中IGF-1生长因子量较高，香烟烟雾水溶物使IGF表达减少，使颗粒细胞凋亡能力增强，卵泡发育受到抑制。同时有研究表明FSH和雌二醇能够促进IGF-1的合成[12]，香烟烟雾水溶物可以通过减少抑制素、雌二醇分泌，降低IGF-1的合成，影响卵泡的发育。

4 香烟烟雾对颗粒细胞线粒体的影响

研究表明，香烟烟雾水溶物使颗粒细胞内线粒体数量减少，结构呈空泡状改变，嵴退行性变，内质网形态变异，该变化主要影响PARKIN和mfn1/2基因表达的变化，通过线粒体影响颗粒细胞结构和功能，导致旁分泌产生的生长因子减少，以及对卵母细胞信息传递减弱，影响女性生育能力[13～14]。

4.1 香烟烟雾线粒体数量结构的影响

线粒体是一种存在于细胞中的由两层膜包被的细胞器，其基质内含有和细胞呼吸代谢相关的酶，能产生供细胞生理活动所需要的ATP，为细胞生命活动直接提供能量，在新陈代谢旺盛的细胞中线粒体居多。正常情况下，卵巢生理活动活跃需要大量的能量，所以在正常颗粒细胞中包含了大量的线粒体。香烟烟雾水溶物引起卵巢早衰时，细胞代谢减弱，所需能量减少，在颗粒细胞中mfn1/2表达下降，PARKIN表达升高后，引起线粒体自噬，线粒体数量减少，进而可通过观察线粒体数目了解香烟烟雾对颗粒细胞的影响，进一步可见其对卵巢生理活动的影响。在计数线粒体数目时，由于每个线粒体中含有1-2套mt DNA，所以可以利用 mt DNA的数量来估计线粒体的数量[15]。当线粒体数量减少，颗粒细胞能量不足，而造成颗粒细胞功能下降。

线粒体结构由外向内分为四层结构，外膜光滑，内膜向内褶皱可形成线粒体嵴。在年轻的颗粒细胞线粒体中具有完整的管状嵴，在年老的颗粒细胞中线粒体则表现为空泡状，嵴和基质发生退行性变化或消失，出现电子致密物，线粒体发生破裂。通过电镜观察和IBAS图像分析仪研究表明，长期接触香烟烟雾水溶物，引起线粒体肿胀变形，嵴不完整甚至消失，线粒体表现出空泡化且膜发生破裂[16～17]，香烟烟雾中存在尼古丁，芳香胺类等物质，会引起线粒体氧化损伤和激活凋亡途径，并且这种损伤程度随着香烟烟雾水溶物浓度的增大而增加。同时香烟烟雾水溶物能使卵巢颗粒细胞中的自噬体增加，线粒体在自噬体的作用下受损[18]，使线粒体形态数量改变。香烟烟雾水溶物通过这几种机制共同影响线粒体形态，使线粒体功能下降，产能减少，影响颗粒细胞功能。

4.2 香烟烟雾对mfn1/2表达的影响

在颗粒细胞内有线粒体融合蛋白1和线粒体融合蛋白2两种亚型，它们分别由mfn1和mfn2基因编码，均匀位于线粒体外膜，两者在N末端有GTP酶结构域，C末端有跨膜区，该特殊结构能促进线粒体融合蛋白1和线粒体融合蛋白2与线粒体外膜结合，它们对触发线粒体融合起重要作用[7]。

mfn1/2在颗粒细胞中可以通过调控颗粒细胞体内线粒体融合蛋白-1和融合蛋白-2的表达影响细胞的能量代谢[19]。香烟烟雾水溶物造成mfn1/2基因表达下降时，引起线粒体膜电位降低，影响线粒体呼吸链复合体亚单位结构及相关酶活性，使颗粒细胞有氧代谢减弱，使细胞由原来的糖摄取转为糖酵解和糖原合成率降低[20]，细胞供能不足，功能受损。

mfn1/2在颗粒细胞中不仅影响着颗粒细胞能量代谢，同时保持线粒体的正常结构。mfn1/2表达产生的线粒体融合蛋白1和线粒体融合蛋白2能够维持线粒体正常的三位网状结构，长期暴露于香烟烟雾水溶物后，mfn1和mfn2基因表达下降，会使线粒体出现膜分裂，导致线粒体由正常的管状连接膜网络结构分裂成小球大泡状膜结构[21]，并且出现没有规律的布朗运动，而使线粒体功能障碍。

mfn1和mfn2不仅在线粒体外膜上表达，同时还在内质网膜上表达。在线粒体外膜或内质网上，线粒体融合2蛋白1和线粒体融合蛋白2可以聚合形成异源二聚体或者线粒体融合蛋白2自我形成同源二聚体，在两者的作用下，介导着内质网和线粒体间的相互作用[22]。长期暴露于香烟烟雾水溶物后，线粒体和内质网上的二聚体形成减少，使线粒体和内质网结合力下降，形态发生改变，线粒体代谢减弱。内质网和线粒体共同影响卵巢颗粒细胞功能，进而影响卵母细胞发育和成熟。

4.3 香烟烟雾对PARKIN表达的影响

PARKIN是由Parkin2基因编码的蛋白质，主要分布在细胞质中，这种蛋白质具有E3泛素-蛋白连接酶活性，能通过泛素-蛋白酶系统来降解细胞内异常的折叠蛋白，调节细胞生理功能，发挥保护作用[23]，同时能通过PINK1-PARKIN信号通路[24]，协调控制线粒体的自噬发生[25]。线粒体自噬是一种选择性清除失用线粒体的自噬过程，调节着细胞内线粒体数量和正常功能，影响着机体内的多种生理过程，该自噬过程主要由Atg基因调节[26]。

在正常情况下，Parkin2基因表达较低，线粒体自噬发生障碍，当长期暴露于香烟烟雾水溶物后，Parkin2基因表达增加，通过PINK1-PARKIN信号通路诱导线粒体自噬体产生，降解被香烟烟雾水溶物氧化损伤的线粒体，使其功能下降而影响颗粒细胞功能，进而减弱旁分泌对卵母细胞的作用，使与卵母细胞之间的信息传递障碍造成卵母细胞功能变化。在该通路中PARKIN中必须依赖PINK1转移到线粒体，才能发挥PARKIN的自噬作用[8]。

PARKIN除了通过自噬影响线粒体形态功能外，还能磷酸化线粒体融合蛋白。香烟烟雾水溶物通过影响氧化应激，能使线粒体功能障碍、基因完整性受损、膜电位下降，促使PARKIN聚集到受损伤的线粒体上。PARKIN在线粒体上使融合蛋白2泛素化[27]，泛素化修饰的mfn2能抑制线粒体融合，mfn2在香烟烟雾水溶物诱导下被PARKIN泛素化，可造成线粒体的融合障碍，线粒体碎片化，受损伤的线粒体单独存在，引起线粒体的功能障碍。香烟烟雾水溶物引起的mfn2泛素化和线粒体碎片化同样也能增强线粒体的自噬作用，导致线粒体数量、结构的改变[28]。线粒体功能下降，颗粒细胞获能不足，同样能降低颗粒细胞功能，影响卵母细胞发育和成熟进而对女性生殖能力造成不利影响。

5 展望

已有研究表明，香烟烟雾能够减少mfn1/2表达和增加PARKIN表达，通过影响线粒体间融合和自噬机制而损伤线粒体的结构和功能[16,17,29]，间接使颗粒细胞受损；同时香烟烟雾也可减少颗粒细胞生长因子的分泌[11,12]，在两种机制作用下通过影响颗粒细胞功能而造成卵母细胞受损，共同作用使女性卵巢功能受影响。

近年来由于香烟烟雾暴露于女性机会增加，国内外学者对此影响进行了一定的实验研究，但是对香烟烟雾水溶物与卵巢颗粒细胞中相关基因表达影响的研究仍然不够深入，仍值得进一步研究。研究香烟烟雾水溶物对卵巢颗粒细胞的影响，对女性的生殖意义重大，能为女性不孕和女性的卵巢早衰研究提供理论依据。