长白红景天提取物抗氧化活性的研究

李承范， 张敬东， 王思宏

( 延边大学 测试中心， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

长白红景天(Rhodiolaangusta)为景天科红景天属多年生草本植物，其在吉林省主要分布在长白、安图、抚松等地，而且数量较少[1].研究[2]表明，红景天属植物具有抗疲劳、抗衰老以及提高免疫能力等方面的药理功效，因此引起了学者的广泛关注.目前为止，有关长白红景天的研究多见于指纹图谱[3-4]、无机元素[5]、解剖学[6]、内生菌[7-8]、种群遗传[9]等方面的研究，但对长白红景天根茎提取物的抗氧化性能的研究未见报道；因此，本文对长白红景天根茎提取物的抗氧化性能进行研究，以期为长白红景天的药用开发提供参考.

1 材料及方法

1.1 材料

长白红景天采于安图县二道白河，并经长白山植物博物馆鉴定；芦丁，中国医药上海化学试剂公司生产； 1,1-二苯代苦味酰基自由基(1,1-dipenyl-2-picrylhydray,DPPH)、特丁基对苯二酚(Tertiary butylhydroquinone,TBHQ)、抗坏血酸(Vc)、二丁基羟基甲苯(Butylated hydroxytoluene,BHT)、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl 缓冲液)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)，Sigma公司生产；邻二氮菲、邻苯三酚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95%乙醇、硫酸亚铁、双氧水、盐酸，天津科密欧化学试剂有限公司生产，且均为分析纯.

1.2 主要仪器

U-3400型紫外分光光度计，Hitachi公司生产； sp210s型电子天平，北京赛多利天平有限公司生产； Q/BKYY31-200型电热恒温鼓风干燥箱，上海青浦沪西仪器厂生产.

1.3 实验方法

1.3.1总黄酮的提取 将乙醇浓度、浸提温度、料液比、浸提时间作为影响总黄酮提取量的因素，利用正交试验确定最佳提取条件，各实验因素水平如表1所示.表2为总黄酮提取因素的正交实验结果表.

表1 总黄酮提取因素水平

表2 总黄酮提取因素正交实验结果

注：Ki表示任意列上水平号为i时所对应的试验结果之和；ki是每列对应值之和的三分之一；R表示极差.

由表2可知，影响提取总黄酮的工艺因素依次为：提取温度、料液比、乙醇浓度、提取时间.由此可知，提取长白红景天时，加40倍长白红景天质量的乙醇(体积分数为80%), 在95 ℃条件下加热提取1 h，提取效果最佳.

1.3.2总黄酮含量的测定 称取55 mg芦丁置于50 mL容量瓶中，加入适量的乙醇(体积分数为70%)，微热溶解后定容至50 mL，质量浓度为110 μg/mL.移取芦丁溶液0.25、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 3.0、 4.0 mL分别置于10 mL的容量瓶中，依次加入0.5 mL亚硝酸钠溶液(质量分数为5%)、0.5 mL硝酸铝溶液(质量分数为10%)、4 mL氢氧化钠溶液(质量分数为4%)，然后用乙醇溶液(体积分数为70%)定容至刻度.参比液为0.5 mL亚硝酸钠溶液(质量分数为5%)、0.5 mL硝酸铝溶液(质量分数为10%)和4 mL氢氧化钠溶液(质量分数为4%).在510 nm处，测量芦丁溶液的吸光度.以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制芦丁溶液的标准曲线并得到浓度与吸光度的线性关系.线性回归方程为：y=-0.008 19x+0.010 01，R2=0.994 5.

图1 芦丁溶液的标准曲线

用正交试验得到的最佳条件提取长白红景天(2 g) 2次，并合并提取液，过滤后转至100 mL容量瓶中定容.取3份1 mL提取液分别置于10 mL容量瓶中，依次加入0.5 mL亚硝酸钠溶液(质量分数为5%)、0.5 mL硝酸铝溶液(质量分数为10%)、4 mL氢氧化钠溶液(质量分数为4%)，摇匀后用乙醇溶液(体积分数为70%)定容至刻度.以蒸馏水为空白对照，在510 nm处测定提取液的吸光度.

1.3.3DPPH自由基的清除率测定 用移液管移取不同浓度提取液0.5 mL，加入1.5 mL乙醇(体积分数为70%)后置于10 mL试管中，再加入2.0 mL DPPH乙醇溶液(2×10-4mol/L)； 充分混匀，静置30 min后在517 nm条件下测定其吸光度Ai.将2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL乙醇(体积分数为70%)溶液混合，摇匀，静置5 min后测定其吸光度Ac.将2 mL提取液(不同浓度)与2 mL乙醇溶液(体积分数为70%)混合，摇匀，静置后测定其吸光度Aj.根据公式(1)计算提取物对DPPH自由基的清除率(RSRDPPH)，并在相同条件下计算TBHQ、Vc和BHT的DPPH自由基清除率.

(1)

1.3.4羟基自由基的清除率测定 取9支试管，依次加入1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲溶液、3.5 mL pH=7.4的PBS和1.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液.在其中的7支试管中，分别加入不同浓度的提取液0.5 mL，混匀，静置.将剩余2支不加提取液的试管分别标记为损伤管和未损伤管，并在损伤管中加入1 mL体积分数为0.01%的双氧水溶液(未损伤管中不加双氧水溶液).再将9支试管用蒸馏水稀释至10 mL， 37 ℃恒温1 h后用同浓度提取液做参比液，在536 nm处测定吸光度.根据公式(2)计算提取物对羟基自由基的清除率(RSR·OH)，并在相同条件下计算TBHQ、Vc和BHT的羟基自由基清除率.

(2)

式中A2为未损伤管中溶液的吸光度，A1为损伤管中溶液的吸光度，A0为提取液的吸光度.

(3)

式中A0为加入提取液之前的邻苯三酚自氧化的吸光度，A1为加入提取液之后的邻苯三酚自氧化的吸光度.

2 结果与分析

2.1 总黄酮提取工艺优化的结果分析

按照最佳提取工艺提取长白红景天，测得所得提取物的总黄酮含量为3.74%,这与正交试验设计中实验8 (表2)接近，表明此工艺条件是合理、可行的.

2.2 长白红景天提取物抗氧化性能的测试

1) 对DPPH自由基清除能力的考察.长白红景天提取物、Vc、TBHQ和BHT对DPPH自由基的清除能力如图2所示.由图2可以看出，在实验浓度范围内，长白红景天提取物对DPPH自由基的清除率均保持在90%～95%之间，与Vc较为接近，且优于TBHQ和BHT.

图2 长白红景天提取物、Vc、TBHQ和BHT对DPPH自由基的清除率

2)对羟基自由基清除能力的考察.长白红景天提取物、Vc、TBHQ和BHT对羟基自由基的清除能力如图3所示.由图3可以看出，在实验浓度范围内，长白红景天提取物对羟基自由基的清除率基本随浓度的增加而增加，清除率保持在63%～100%之间；Vc、TBHQ和BHT在实验浓度范围内对羟基自由基的清除率保持在40%～60%之间.这说明，长白红景天提取物对羟基自由基的清除活性优于Vc、TBHQ和BHT.

图3 长白红景天提取物、Vc、TBHQ和BHT对羟基自由基的清除率

3)对超氧阴离子自由基的清除能力的考察.长白红景天提取物、Vc、TBHQ和BHT对超氧阴离子自由基的清除能力如图4所示.由图4可以看出，在实验浓度范围内，长白红景天提取物、Vc、TBHQ和BHT对超氧阴离子自由基的清除率范围分别为： 27%～50%、15%～32%、22%～32%、 21%～30%，这表明长白红景天提取物在实验浓度范围内对超氧阴离子自由基的清除率优于Vc、TBHQ和BHT.

图4 长白红景天提取物、Vc、TBHQ和BHT对超氧负离子自由基的清除率

3 结论

本文研究表明，长白红景天提取物总黄酮提取工艺的最佳条件是加40倍长白红景天质量的乙醇(体积分数为80%),在95 ℃条件下加热提取1 h.在最佳工艺条件下，测得长白红景天提取物中总黄酮的含量为3.74%.长白红景天提取物在实验浓度范围内对3种自由基(DPPH、羟基、超氧阴离子)均有较好的清除能力，且对3种自由基的清除能力均优于Vc、TBHQ和BHT.另外，长白红景天提取物对DPPH的清除能力也优于玫瑰红景天(R.roseaL.)[10]：因此，长白红景天是一种优良的抗氧化活性的植物.本文在研究中未对提取物中的抗氧化单体化合物进行分离和鉴定，今后将对此进行研究.