诱发肺气肿动物模型方法及评价

2019-02-11张丹参

神经药理学报 2019年5期

张丹参李兰

河北科技大学，石家庄，050018，中国

肺气肿是呼吸内科疾病中很常见的一种慢性肺功能不全，是以逐渐破坏肺泡结构，严重者导致通气换气等功能障碍引起缺氧，最终会因肺心病、呼吸功能衰竭致死的疾病［1-3］。主要是指终末细支气管远端（呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡）的气道弹性降低，过度膨胀、充气和肺容积增大或同时伴有气道壁破坏的病理状态［4］。其发病机制目前认为是由于多种因素破坏支气管壁，使管腔狭窄，形成不完全阻塞和肺内弹性蛋白酶/抗弹性蛋白酶系统失衡［5］；以及肺部的慢性炎症使白细胞和巨噬细胞释放的蛋白分解酶增加，损害肺组织和肺泡壁，致多个肺泡融合成肺大泡或气肿；而肺泡壁的毛细血管受压，血液供应减少，肺组织营养障碍，也引起肺泡壁弹性减退，易促进肺气肿［6-7］。因此，建立合适的肺气肿动物模型是为研究肺气肿新治疗方法的关键。

1 动物的选择

人们对造成肺气肿的病因以及发病机制的认识不断加深，其动物模型的实验诱导方法也逐渐完善。但目前的问题是仍然不能够复制出与人类肺气肿病变特征完全相似的动物模型，也不能完全模仿人类病变的过程。常用于研究肺气肿的动物模型有鼠类（小鼠、地鼠、大鼠、豚鼠）、比格犬、小型猪、兔到灵长类的猴［8］。鼠类最适合用于制作单纯的肺气肿模型，鼠类基因与人类基因相近，因其饲养方便，繁殖速度快，饲养费用低，研究时间周期短等优点；小型猪的肺组织与人类较为相似，灵长类的动物肺组织模型更能接近与人类，但是选择动物模型要充分考虑可行性、易操作性、经济性的角度，选择合适的动物，对于实验的顺利进行具有重要的影响。在对动物进行气管插管时，相对于大鼠和豚鼠，小型猪的气管比较粗，利于插管。

2 诱导肺气肿动物模型方法

目前，肺气肿动物模型在制作上主要有四种方法：蛋白水解酶法［9］、烟雾吸入法［10］、化学药物法［11］、基因诱导法［12］等。

2.1 蛋白水解酶法致肺气肿模型

弹性蛋白酶通过静脉注射、气管内滴入、气管切开、雾化吸入［13］等给药途径来诱导动物模型肺气肿，肺组织部的抗蛋白酶的平衡被滴入的弹性蛋白酶所打破，产生的炎症因子能加速肺泡壁溶解、破裂与融合从而形成肺气肿动物模型［14-15］。

蛋白水解酶法通过对兔进行雾化吸入和静脉内注入木瓜蛋白酶进行造模，能准确反应出肺气肿的临床特点，方法简便，比起烟雾吸入法来，减少了劳动量和危险性，模型较为稳定，制作时间短，不易出现感染及不良反应。蛋白水解酶的方法虽然简便且相对稳定，但是病变往往分布不均匀并且这种方法诱导的病理改变人类常见的由于长期吸烟引起的肺气肿不完全一致［16］。气管内滴入酶液直接作用于肺部，较静脉途径直接且避免了血液成分的干扰；酶液定量准确，避免了雾化吸入剂量不准、操作复杂的缺点。总体来说，蛋白水解酶法制作的模型适应性强，能根据需要在不同时间接受不同的干预措施，因此可用于肺气肿和肺心病的发病机制、病理改变、药物疗效观察及相关疾病手术的有关研究。

2.1.1 气管内滴注法致肺气肿模型

2.1.1.1 大鼠气管内滴注法致肺气肿模型 Sneha Dhapare［17］等采用气管内滴注的方法建立肺气肿模型，大鼠体质量180～200 g，腹腔注射20 mg·kg-1戊巴比妥钠，并加入乙醚。分离暴露气管，用4 号细针穿刺两软骨环间，向气管内快速推注3%猪胰弹性蛋白酶或木瓜蛋白酶液（1 mg·kg-1），推完后立即拔出针头，使大鼠保持直立位，左、右来回旋转1～2 min，使酶液尽可能均匀地达到两侧肺的深部。滴注酶液后2个月可作为肺气肿动物模型。肺组织病理检查可见，肺泡隔数量明显减少，所存留肺泡隔变窄，部分肺泡隔断裂、消失，若干肺泡融合成大圆囊，甚至肺泡管扩张，可作为肺气肿的形态学指标。目前多采用气道内直接注射蛋白酶类来复制肺气肿的模型。

2.1.1.2 小型猪气管内滴注法致肺气肿模型邓丹［18］采用小型猪作为动物模型，选健康成年的小型猪15只，麻醉前4 h 禁止饮食，在耳后肌肉内注射0.1 g·2 mL-1每支盐酸氯氨酮注射液进行静脉滴注（15 mg·kg-1），麻醉后将无菌软管的一段润湿，经鼻孔插入气管，软管外端插入无菌生理盐水杯确定软管在气管内后，将剂量为6 U·kg-1木瓜蛋白酶溶液注入气管，然后使用生理盐水冲管。3 d 后按照上述方法注入剂量为300 U·kg-1的猪胰弹性蛋白酶。

2.1.1.3 白兔气管内滴注法致肺气肿模型陈建新［19］采用白兔作为动物模型，选择体质量为1.5～2.0 kg 的健康白兔，雌雄不限，氟哌利多注射液2.5 mg·kg-1和盐酸氯胺酮注射液50 mg·kg-1，混合注射白兔臀部肌肉进行麻醉，直至适宜程度，内径为3.0 mm 的气管插管插入兔的气管中，使用生理盐水稀释胰弹性蛋白酶，按照2 000 U·kg-1的注射量，3 mL 经气管插管缓慢的注入兔肺气肿模型，对照组则注入3 mL 生理盐水作为对照组。实验42 d 后解剖动物，分析其动物肺功能。

2.1.2 气管切开滴注法致肺气肿模型

Luiz Marcelo Oliveira Santos［20］采用体质量为25～30 g 雄性瑞士小鼠，正常光照并正常喂食标准食物和水，使用氯胺酮（34 mg·kg-1）和甲苯噻嗪（12 mg·kg-1）腹腔注射麻醉小鼠，前切口暴露气管，并滴注溶于无菌盐水的猪胰弹性蛋白酶诱导肺气肿模型组，正常对照组滴注无菌盐水。

2.1.3 雾化吸入法致肺气肿模型

2.1.3.1 家兔雾化吸入法致肺气肿模型晋云［21］等采用雾化吸入法建立动物模型。家兔体质量1.8～2.0 kg，超声波雾化器为自制雾化箱（70 cm×40 cm×30 cm，前面有一2 cm×2 cm 大小进雾孔，后面及两侧各有一1 cm×1 cm 大小通气孔）。2%猪胰弹性蛋白酶或5%木瓜蛋白酶50 mL，经超生雾化器将酶液雾化后（直径5 μL 以下颗粒占90%以上，50～60 mL 约4 h 雾化完）经管道送入自制雾化箱，动物经雾化吸入箱的开口处吸入酶的气雾剂。每次吸入约4 h（至酶液雾化完），每周吸入一次，共3次。末次吸入后40 d，即可作为肺气肿动物模型进行实验观察。

2.1.3.2 新西兰兔雾化吸入法致肺气肿模型李娴［22］采用体质量为2.8～3.4 kg 健康新西兰雄性成年大白兔，饲养温度为室温，普通专用饲料饲养，随机分为健康对照组及肺气肿模型组，将2 g 猪胰弹性蛋白酶溶于150 mL 的0.9% NaCl 溶液中，倒入雾化装置中，适应性喂养一周后，通过自制雾化箱持续性雾化等量的猪胰弹性蛋白酶，对照组吸入等量的0.9% NaCl 溶液，每周雾化一次，每次90 min，持续4周，其余时间正常喂养，以相同的方法处理后，正常饲养6周。通过外周血采集及血常规检测、末梢血氧饱和度及心率测定、肺容积测定等方法确定造模成功。

2.2 烟雾吸入法致肺气肿模型

将自制的烟雾弥漫在自制熏烟箱中，模型组动物将其每天吸取一定量的自制烟雾，一段时间后复制肺气肿模型成功。

此实验方法更适合用于小动物，需要制定特定的密闭容器，然后按计划给予烟熏，如果体型较大的动物，可能会撞击容器引起损伤，大动物的造模时间长，且大型动物不易控制。此模型稳定性好。

2.2.1 大鼠烟雾吸入法致肺气肿模型

安立［23］选择鼠龄为6周的雄性大鼠，体质量不超过150 g，限制其饮食，将大鼠置于自制的有机玻璃烟熏箱内，箱顶留有直径通气孔，箱内放置钠石灰吸收CO2，以无水CaCl2吸收水蒸气，将香烟点燃接于烟嘴上，用注射器连续吸入香烟烟雾并通过接有三通的输液管注入箱内，连续点燃5 支香烟产生烟雾，每周五天，每天90 min，共5个月。末次吸入的第二日作为肺气肿动物模型。长期吸烟会造成肺部的巨噬细胞发生炎症，从而导致支气管管腔变狭窄和支气管软骨组织破损而导致肺泡增大、破裂、融合，形成肺气肿。

2.2.2 新西兰兔烟雾吸入法致肺气肿模型

王培培［24］将雄性健康新西兰大白兔随机分成2组，正常对照组和烟熏模型组，烟熏组置于定制的兔笼中，上下两层，将兔置于上层，下层放置酒精灯燃烧烟丝，早晚2次燃烧，每次燃烧15 g，每次30 min，连续70 天，正常对照组不熏烟。实验过程中观察动物的情况，烟熏至70 天的病兔停止烟熏1周，检查行血气分析、测定肺功能、处死后右肺性支气管灌洗液分析、左肺作病理切片。

2.2.3 小鼠烟雾吸入法致肺气肿模型

赵考昌［25］选择鼠龄为6～8周，体质量在20～25 g 的小鼠，将吸烟组的小鼠置于自制的烟熏箱中，每天烟熏4 h，每周烟熏5 d，连续24周，烟熏箱内最佳烟雾和空气的比例为1∶6，烟熏期间使用医用氧气舱测氧仪监测舱内的氧浓度使其不低于18%，正常对照组小鼠置于空气环境优良的空间内，24周后以90 mg·kg-1腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉吸烟组与非吸烟组的小鼠，以HE 染色和流式染色的方法确定模型构建的程度。

2.2.4 豚鼠烟雾吸入法致肺气肿模型

陈辉［26］选择12周龄的英国短毛雄性豚鼠，自制被动吸烟装置，吸烟组的豚鼠每次10 支焦油量12 mg，烟碱量0.9 mg 的大前门牌香烟，每次持续2 h，每天2次，每周被动吸烟6 天，烟熏持续12周，对照组不做任何处理，12周后处死。通过HE 染色病理观察到肺泡壁变薄，肺泡腔被破坏，炎症细胞被浸泡，平均肺泡半径大于对照组。

2.3 化学药物法致肺气肿模型

多种化学药物可以引起肺部的炎症及肺气肿，这些药物包括脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、氯化镉、二氧化氮和臭氧等等。脂多糖是由呼吸道发生感染的细菌产生的，脂多糖是组成革兰氏阴性菌内毒素的主要成分，化学药物进入肺脏后分泌一系列炎症因子介导一系列炎症反应，破坏蛋白酶/抗蛋白酶系统，导致肺气肿［27］。

化学药物造模方法能短时间内复制出由于吸烟所致的肺气肿，能够直接破坏周边肺泡壁的结构形成肺气肿。

2.3.1 内毒素法致肺气肿模型

刘蕾［28］等采用气管内滴注脂多糖的建模方法，大鼠用1%的戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于大鼠固定板，暴露声门，将18 号静脉套管针快速插入气管，拔出针芯，用1 mL 注射器注入溶于生理盐水的LPS 200 μL（1 g·L-1），然后将大鼠固定板直立旋转，使LPS 能够均匀分布于两肺。正常组注入生理盐水。模型组和正常组的大鼠饲养3周。该模型的实验结果显示正常组大鼠精神状态好，活动能力强，营养良好，被毛白皙有光泽，爪甲颜色呈淡粉色、有光泽，舌淡红，苔薄，饮食正常，体质量增长迅速，呼吸平稳，无喉中痰鸣、无咳嗽、气促等现象，二便正常。模型组动物在气管内滴注LPS 后，逐渐出现精神情况欠佳、咳嗽、喘促等情况，说明建模成功。

2.3.2 氯化镉法致肺气肿模型

Snider［29］等通过氯化镉的方法建造肺气肿动物模型，具体方法如下，挑选体质量为120 g 的雄性仓鼠，并用CO2麻醉仓鼠并接受单次经气管内滴注0.5 mL 0.15 mol·L-1NaCl 溶液，模拟组的仓鼠0.025% CdCl2（0.5 mL·100g-1），正常对照组不做任何处理。在5、10、21、42、105 和180 d 进行研究，对模型组和对照组进行生理学、形态学和生物学研究。

2.3.3 NO2法致肺气肿模型

Wegman［30］等通过将小鼠长期放在低浓度NO2的方法造模成功，将至少圈养1周的小鼠暴露于20 ppm NO2的暴露室中25 d，每天维持14 h，该室具有用于气体混合的入口和出口以及用于确保整个室内的气体均与分布，连续气流调节12 L·min-1。对模型组分析其肺组织学检查其造模程度。