诱发肺动脉高压动物模型方法及评价

张丹参 李佳瑛

河北科技大学，石家庄，050018，中国

肺动脉高压是一种由于肺血管重构而发展起来的疾病，其特点是小肺动脉狭窄，导致平均肺动脉压和肺血管阻力增加［1］，引起肺动脉压力升高、肺血管阻力增加，其形态学特征是肺动脉血管结构重建和右心室肥大。肺动脉高压本身不是疾病，而是由平均肺动脉压超过正常上限定义的病理生理参数，即静息时＞25 mmHg。慢性肺疾病引起的持续性肺动脉高压的机制十分复杂，缺氧是各种肺动脉高压发生的最主要因素，虽然对肺动脉高压的研究已经有许多年，但其发病机制尚未完全明了，而且目前的治疗措施也很匮乏。因此，对肺动脉高压的研究刻不容缓［2-3］。制备缺氧性肺动脉高压动物模型，选择标准化及与实验目的相适应的实验动物进行实验，是进行有关缺氧性肺动脉高压发病机制或药物治疗研究成功的关键所在［4］。

1 肺动脉高压模型方法

肺动脉高压模型的建立方法主要有以下几种：①利用低氧诱导肺动脉高压模型；②利用药物、异物诱导肺动脉高压模型；③通过手术分流建立肺动脉高压模型；④借助基因工程建立肺动脉高压模型；⑤混合干预建立晚期肺动脉高压模型等［3］，以慢性缺氧性肺动脉高压模型应用较多。

1.1 常压缺氧致肺动脉高压模型

将大鼠置于改进的常压低氧装置内，通入氮气，用自动测氧仪调控氧浓度至（10±0.5）%。当舱内氧浓度低于9%时，报警装置启动，使大鼠大致因低氧死亡。CO2传感器可反馈控制钠石灰装置的电磁阀门，使舱内CO2始终维持在0.03%。温度传感器及其控制电路可维持舱内温度始终恒定在22℃～24℃。舱内空气干燥，水蒸气由变色硅胶吸收（烘干后可反复使用），缺氧组每天6 h 连续6周［4-5］。

本低氧装置能准确、方便地复制低氧肺动脉高压模型，稳定性好，独立性强，不受外界环境影响，整个缺氧过程做到完全自动化，省时省力，经济高效，能较好满足常压低氧条件需要，较常规方法更接近于常压单纯低氧所致的肺动脉高压。

1.1.1 家猪常压缺氧致肺动脉高压模型

孙依萍等人［6］将猪常规麻醉后行气管切开插管术，接入呼吸机，先进行正常通气，吸入氧浓度为50%，潮气量为80～100 mL，呼吸频率30～35次·min-1，进行机械通气。经右侧颈外静脉插入5F 四腔漂浮导管至肺动脉，监测肺动脉收缩压、心率，用热稀释法测定心搏指数，经右股动脉插入导管监测动脉收缩压，并由此抽动脉血送检血气。经右股静脉插管建立静脉通道。正常通气1 h 后，测定肺动脉收缩压、股动脉收缩压、心搏指数、血气分析和静脉血一氧化氮（nitric oxide，NO）含量。进行低氧通气，即吸入氧浓度14.7%的氧气与氮气混合气体。30 min 后缺氧模型建立。

1.1.2 家兔常压缺氧致肺动脉高压模型［7-8］

阮营辉等人用10% 乌拉坦（10 mL·kg-1）腹腔内注射麻醉后，分离兔右侧颈外静脉，一端从颈外静脉插入，另一端与多导生理仪连接并和压力传感器、监护仪及记录仪相连以测定并记录平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）和右室收缩压（right ventricular systolic pressure，RVSP）。随之气管插管，接婴儿人工呼吸机记录基础MAP，SRVP 值。实验家兔依次编号1～30，随机分组，对照组（10只）家兔FiO 0%～225%常氧通气，缺氧PAH组（20只）家兔送检血气分析后，改Fi 29%～15% 低氧通气。待SRVP 上升4 h 后立即分离左侧颈总动脉，将3F 聚乙烯导管塑料导管一端从颈总动脉插入，另一端与三通连接，便于用肝素生理盐水（100 U·kg-1）冲洗导管和抽血。先分别抽取动脉和静脉血送检。然后在实验终点分别采用左右心导管术测定肺动脉、右心室压力和左心室血液动力学指标。

1.1.3 大鼠常压缺氧致肺动脉高压模型［9-11］

刘银花等人24只清洁级雄性SD 大鼠，体质量207～235 g，随机分为3组（每组8只）：①正常对照组，低O2高CO2+生理盐水组（normal saline，NS）和低O2高CO2+HA组（HA）。②将HA组和NS组置于常压低O2高CO2：舱中，通过N2和CO2：调节舱内O2和 CO2浓度，使O2浓度控制在9%～11%，CO2浓度在5%～6%，温度控制在23℃～27℃，湿度在7%～50%，每天6 h，每周8 d，共4周。大鼠自由摄食摄水。每天将大鼠放人氧舱前，HA组腹腔注射羟胺溶液（12.5 ms·kg-1，1 mL，NS组腹腔注射1 mL 生理盐水。定期称量动物体重，根据体质量变化调整药物用量［11］。

1.2 减压缺氧致肺动脉高压模型

将动物置于全自动调节低压低氧舱（大气压约50 kPa，氧浓度10%）内，进行间断性低氧，每天8 h，连续4周，模拟海拔5 000～5 500 m 高度的气压环境，建立低压低氧性肺动脉高压模型；分别于1周（8只）、2周（8只）、4周（8只）给大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠40 mL·kg-1进行麻醉。

此方法在整个缺氧过程中舱内氧浓度始终维持在10%左右，舱内空气干燥，温度与室温基本一致，重要的是，在缺氧开始阶段和结束阶段由于有缓冲舱，使低压低氧舱中的压力能够平稳的下降和上升，并且大鼠在低氧过程中的死亡率几乎为零。装置低压低氧舱容积大，可容8只大鼠，能准确、方便地复制低压低氧性肺动脉高压模型，稳定性好，整个低氧过程中做到了完全自动化、省时省力［12-14］。另外，本装置也可经简单调整后，模拟不同高度的高原的气压环境。

1.2.1 豚鼠减压缺氧致肺动脉高压模型

李留树等人［15］用豚鼠40只，体质量400 g 左右，雌雄各半，其中30只为实验组，另10只为对照组。按上述方法复制肺动脉高压模型。分别于缺氧第1、2和4周最后一次缺氧试验后用10%乌拉坦腹腔麻醉，以穿刺法经颈外静脉插管直到肺动脉、经P23 压力换能器接多道生理记录仪，分别测肺动脉压（pulmonary arterial pressure，PAP）和右心室压（right ventricular pressure，RVP），然后取血测心钠素和血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE），测定方法为放射免疫法和分光光度法。放血后，将动物开胸，取出心脏，剪去心房组织，沿室间隔边缘剪下右心室、左心室和室间隔并称重，以右室（左室+室间隔）将重量比和右心室重/体重表示右心室重量的变化，确定有无右心肥厚，若有右心室肥厚，则建模成功。

1.2.2 大鼠减压缺氧致肺动脉高压模型［16-19］

吴东红等人用清洁级雄性SD 大鼠40只，随机取组法分成4组：正常对照组（NC）、低 O2高 CO21周组（1 HH）、低O2高CO22周（2 HH）和低 O2高 CO24周组（4 HH）。将后3组动物放入常压低 O2高 CO2舱内，使O2浓度维持在9%～11%，CO2浓度维持在5%～6%，每天8 h，每周6 d，连续4周。对照组大鼠除吸入空气外，其他饲养条件与各低 O2高 CO2组相同。动物饲养到规定时间后，用戊巴比妥钠（35 mL·kg-1）腹腔麻醉，右心导管法测定平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）。放血处死动物，迅速剪开胸腔取出心肺，右下肺置于4%多聚甲醛-PBS 液（含0.1% DEPC）中固定。剪去右心房组织，沿室间隔边缘剪下右心室，分别称取右心室游离壁和左心室加室间隔的重量，并计算出它们的重量比，作为右室肥大的指标，若有右心室肥厚，则建模成功。

1.3 野百合碱皮下注射肺动脉高压模型［20-23］

雄性Wistar 大鼠，将野百合碱性结晶配成2%溶液，以50 mL·kg-1一次性肩胛区皮下注射。于注射后12，16，24 天分批处死动物。测定右心室和肺动脉压力，以及进行心肺病理检查确定肺动脉高压的指标包括功能和形态学两方面，其中最直接的证据是肺动脉压力升高。也可将野百合碱脱氢处理成脱氢野百合碱，经心导管注入犬右心房制作肺动脉高压动物模型，与注射药物后4周、8周测定肺动脉压力等血液动力学参数，并行肺组织病理学检查。或者，采用野百合碱复合左肺切除法建立慢性肺动脉高压大鼠模型［20］。

野百合碱复合左肺切除法建立慢性肺动脉高压大鼠模型特点：大鼠价格低廉、手术过程相对简单、实验重复性好，5周内即可完成慢性肺动脉高压模型建立，明显短于既往的单纯分流方法，适用于肺动脉高压实验研究。

1.3.1 犬野百合碱皮下注射肺动脉高压模型

赵永红等人［21］用氯胺酮5 mL·kg-1静脉注射麻醉动物犬，保持清醒状态，经股静脉穿刺5F 导管入右心房右心室，肺动脉主干及右下肺动脉测定中心静脉压、右室收缩压、肺动脉收缩压、肺动脉平均压，于左下肺动脉远端测定楔压等压力参数，经股动脉检测体循环。野百合碱组经右心房注入野百合碱组经右心房注入野百合碱，对照组注入等量DMF。动物饲养到4周、8周时，重复测定上述部位压力。8周时随机抽取对照组6只，实验室6只动物处死。氯胺酮5 mL·kg-1肌肉注射诱导麻醉，速眠新1 mL·kg-1静脉注射，气管插管接呼吸机，经第5 肋间进胸，与肺门处理10 mm×10 mm×5 mm 大小的肺组织，以4%的中性甲醛固定72 h 后，石蜡包埋，经HE 和VG 改良法染色做病理检查，建立肺动脉高压动物模型。

1.3.2 大鼠野百合碱皮下注射肺动脉高压模型［3，22-23］

马凯等人用清洁级雄性大鼠75只，体质量（160～180）g，随机分为C组、M1组、M2组、M3组和M4组，每组各15只。分别腹腔注射不同剂量野百合碱4周后检测各项指标。其中组大鼠一次性腹腔注射野百合碱，剂量分别为（30、40、50、60）mL·kg-1，诱导建立肺动脉高压动物模型。

1.4 血管分流术致肺动脉高压模型

实行麻醉大鼠腹主动脉和下腔静脉分流手术，制作肺动脉高压动物模型。手术历时1 h 左右，术后约30 min，大鼠出现抬头、四肢蠕动等苏醒征侯，后出现翻身活动。术后6周，大鼠肺动脉压力明显升高，右心室肥厚。同时肺血管结构发生重建，肺动脉中膜增厚、肌化程度增加和内膜细胞增生，术后11周肺动脉高压形成。此外，还有家兔、大鼠右颈总动脉和颈外静脉用套管连接法连接制作大鼠颈部肺动脉高压动物模型。

有资料表明，大鼠心脏机能、心血管系统的生物学特性与人类有着极大的相似性，且大鼠体积小，价格低廉。腹主动脉和下腔静脉分流使回心血量增多，肺循环血流量相应增加，影响了肺血管内皮细胞的结构、功能和代谢，进而促进肺动脉高压的形成。较既往的左向右分流型先天性心脏病动物模型的制备相对简单，实验重复性好，动物死亡率低，因此用大鼠作为该模型的首选动物十分合适。但是，不能除外高血流对下腔静脉的影响导致全身体液失衡进而促进肺动脉高压的形成，对此尚有待进一步研究。

1.4.1 家兔血管分流术致肺动脉高压模型

张凤伟等人［24］向兔耳缘静脉注射2.5%戊巴比妥钠（30 mL·kg-1），麻醉成功后，仰卧固定于手术板上，颈部皮肤去毛并消毒。采用颈部正中切口，长约3 cm。显露右侧颈外静脉，耳缘静脉注射肝素1 mL·kg-1抗凝后，在颈外静脉第一个属支下方结扎其远端。游离右侧颈总动脉，近心端用小血管夹阻断血流，在颈内、外动脉分叉处下方约0.5 cm 处结扎并斜行切断颈总动脉。用小血管夹阻断颈外静脉近心端，于颈外静脉内侧适当位置做一约2 mm 切口，在显微镜下使用7-0 Prolene线行颈动—静脉端侧吻合。先后松开颈外静脉和颈总动脉近心端的血管夹，如发现颈外静脉近心端充盈并出现搏动性鲜红色血流，证明吻合口通畅良好。切口内放入少许青霉素粉剂预防感染，逐层缝合皮下组织及皮肤。以肺动脉收缩压＞30 mmHg，平均肺动脉压＞20 mmHg为制模成功标准。

1.4.2 犬血管分流术致肺动脉高压模型

左顺庆等人［25］选择健康杂种犬6 条，体质量（10～20）kg，雌雄不限。动物在全麻插管下经左侧第4 肋间开胸。血管吻合方法：2 条犬利用左肺动脉上叶分支近端与降主动脉行端侧吻合，4 条犬利用左锁骨下动脉与左肺动脉行端侧吻合，吻合口4～6 mm，吻合完毕肺动脉侧向近心、远心端均有明显震颤。吻合前测定肺动脉、体动脉平均压作正常对照。术后常规笼中饲养4～6个月。

1.4.3 大鼠血管分流术致肺动脉高压模型［26-27］

周菁等人向大鼠腹腔内注射4% 的水合氯醛（100 g·kg-1）麻醉。取腹正中切口，用两根棉签将大鼠肠腔拖出腹壁外，予生理盐水湿纱布包裹，保持组织湿润，以防水分蒸发。用两根棉签钝性分离后腹膜，充发暴露腹主动脉和下腔静脉，用双极电凝对腹主动脉两边的髂腰动静脉以及到脊柱的向后的3 根细小动脉进行电凝。肝素抗凝后，用细线于左肾动脉起始部下方以及髂总动静脉上方将腹主动脉和下腔静脉阻断。以腹主动脉的左肾动脉起始部至其末段的下2/3 处之左侧壁为造瘘处，用自制刮胡刀片的尖刃在腹主动脉壁上划出1 mm 长的刀口以动脉三层刀口对齐为好，可在显微镜下清楚看见稍呈蓝色的对侧壁，用20 G 静脉穿刺套管针在对侧壁轻轻刺出一破口，用显微镊子的一侧尖头刺入相邻的下腔静脉内，再用显微镊子的两个尖头刺入相邻的下腔静脉内，轻轻扩大瘘口，再用20 G静脉穿刺套管针的外套管再次扩大瘘口，此步操作需轻柔，勿穿破下腔静脉对侧壁。用7-0 线缝合腹主动脉壁的穿刺口。松解两端用以阻断的细线，显微镜下若可观察到下腔静脉增粗、颜色由暗变红或血流有波动，则证实分流存在，即可缝合腹壁，则建模成功。

1.4.4 猪血管分流术致肺动脉高压模型

Jiang Y Y 等人［28］建立了仔猪左向右分流致PAH模 型（n=9；4月龄；体质 量（22.8±2.3）kg；公 母比 例4∶5）。肌肉注射盐酸西拉嗪（2 mL·kg-1）。2 2F 穿刺针建立耳廓静脉通路后，静脉注射丙戊酸（1 mL·kg-1）和芬太尼（5 mL·kg-1），罗库溴铵（0.5 mL·kg-1）静脉滴注，机械通气。左四肋间隙切口显露胸降主动脉和肺动脉干。用6-0 聚丙烯临时夹闭胸主动脉降主动脉，缝合直径6 mm 的人造血管。移植物的另一端与肺动脉吻合。术中测定分流前后收缩期肺动脉压、舒张期肺动脉压及肺动脉压。然后关闭胸腔，将仔猪送回饲养室，并进行6个月的随访。

1.5 慢性血栓栓塞性肺动脉高压模型

采用自体血栓连续注射法建立慢性血栓栓塞性肺动脉高压动物模型。犬麻醉后取血50 mL，加入凝血酶，形成血栓，将血栓剪成直径3～5 mm，长8～10 mm 圆柱形备。切开颈外静脉插入7F 导管，向颈外静脉内注射自体血栓，直至肺动脉平均压达到45 mmHg，快速推注生理盐水10 mL。达到实验标准后，缝合静脉切口及皮肤切口，给予抗生素，动物饲养15，30，60 天后，重复上述麻醉和注栓实验步骤。所有动物分别于第一次注栓前和注栓后第90 天，记录平均肺动脉压、肺毛细血管嵌压、心输出量、呼吸频率、潮气量、气体流速、胸内压［29］。

本实验模型的建立完全模仿了深静脉血栓脱落后多次肺栓塞事件的发生。在预实验中，发现静脉血栓的形状、性状、数量和流入速度决定肺栓塞的面积和肺动脉压力升高的情况。放弃了传统血栓模型股静脉入路而采用颈静脉入路是为了缩短栓子在体循环血管的行程，减少破碎的机会。动物模型建立成功率为83%，用自体血栓连续注射法建立慢性血栓栓塞性肺动脉高压动物模型有较高的可行性。

1.5.1 家猪慢性血栓栓塞性肺动脉高压模型［30-31］

Ehlermann 等人采用健康家猪，体质量20～30 kg，雌雄不限。抽取猪自体静脉血5 mL 注入直径为4 mm的聚乙烯管中，置于冰箱中冰存24 h，形成血栓，洗涤后备用。实验前15 min 分别肌注氯胺酮（20 mL·kg-1），地西泮10 mg 和阿托品15 mg 进行麻醉，观察家猪睫毛反射消失后，固定于自制木板架上。用右心导管置于右肺动脉远端的大分支处，在 X 射线单向影像系统的监视下，向肺动脉推注事先准备好的同样剂量的人工血栓，造成人工肺动脉栓塞的动物模型。此模型注入的栓子除自体血凝块外还可以使用明胶海绵块，亦可直接从颈静脉插管注入自体血凝块，还可用右心导管置于右肺动脉远端的大分支处，在X 射线单向影像系统的监视下，向肺动脉推注事先准备好的由折叠多重的线圈和组织粘合剂制成的栓子，或者葡聚糖凝胶G-50制成的栓子，反复三四次，造成人工肺动脉栓塞的动物模型。

1.5.2 大鼠慢性血栓栓塞性肺动脉高压模型

王海龙等人［32］采用大鼠，体质量200～250 g，雄性，应用1%戊巴比妥（40 mL·kg-1）腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，置含有200 U·mL-1凝血酶的无菌玻璃平皿中静置过夜，弃血清后，生理盐水冲洗，剪成0.5 mm左右大小的栓子，实验组经颈静脉用1.5 mL 生理盐水缓慢注入栓子 27～30个，制备肺栓塞模型；对照组经颈静脉注入生理盐水1.5 mL。2周后以同样方法进行二次栓塞。2次术后3 d 内均肌肉注射庆大霉素0.1 万单位·kg-1预防感染，1次·d-1；全程腹腔注射氨甲环酸（12.5 mL·kg-1），1次·d-1，建模成功。

1.5.3 犬慢性血栓栓塞性肺动脉高压模型

Zhang YM 等人［33］选用健康杂种犬，性别不限，体质量13～19 kg，所有犬给予50 g·L-1戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，剂量为0.6 mL·kg-1。麻醉后仰卧位固定于手术台。气管内插入气管插管固定。颈部剪毛后，碘伏消毒，暴露颈外静脉，在无菌条件下取血50 mL，加入500 U 凝血酶后于平皿内混匀，室温下静置约1 h，形成血栓，将血栓剪成直径3～5 mm 圆柱形备用。切开颈外静脉，插入7F 标准三腔漂浮导管，另一切口插入7F 导管深度15～18 cm 至右心房，接传感器监测肺动脉压。经7F 导管缓慢注入先前制备的血栓5～10 min，直至肺动脉平均压达到45 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。快速推注生理盐水10 mL，以防栓子滞留于导管或颈静脉内。手术结束后，用7-0 线缝合血管插管口，缝合手术切口。苏醒后放回动物实验中心饲养，温度23℃，空气湿度60%。并给予肌肉注射青霉素预防感染。在第1次注栓后15，30，60 d，重复上述麻醉和注栓步骤，建模成功。

2 制备肺动脉高压模型注意事项

常压低氧装置中水蒸气要除尽，舱内气体用小风扇不断混匀且舱内的二氧化碳和水蒸气分别用钠石灰和氯化钙吸收。低压低氧舱中变色硅胶是用来干燥低压低氧舱中的大鼠呼出的湿气和CO，保证了从低氧舱抽出的气体经干燥后进入缓冲舱中，同时也保证了低压低氧舱中的环境的干燥。手术操作宜轻柔、迅速，尽可能减少对动物的创伤。

手术中，暴露的肠管需用生理盐水湿纱布包裹，保持组织湿润，以防水分蒸发。在造瘘时，最好从动脉向静脉进行，动脉壁弹性好，易于缝合。静脉壁薄，易撕裂。动脉切口以动脉三层刀口对齐为好。用20G 静脉穿刺套管针扩大瘘口时操作需轻柔，勿穿破下腔静脉对侧壁。松解细线解除阻断时，先稍松解下端细线，用棉签轻压下端细线远端，这样可压碎一些小血栓，防止小血栓凝成大血栓，堵塞大血管，导致大鼠死亡。然后彻底松解下端细线，血液立刻充盈阻断部位血管，在腹主动脉切口缝合处，可形成细小血栓，防出血，亦可加用小块明胶海棉，盖在腹主动脉切口缝合处，增加止血效果。然后稍松解上端细线，同样用棉签轻压上端细线近端。最后彻底松解上端细线，因腹主动脉压力大，阻断处一下冲开，两条大血管重新贯通。外科操作要求准确、娴熟，手法轻柔、到位，否则易引起大出血等意外情况。

在制栓过程中添加凝血酶，是为了使栓子能够对抗肺较强的血栓自溶能力而不易破碎，以提高成功率。栓子被剪成小圆柱型缓慢多次注入，是为了避免血栓聚集成团块，堵塞肺动脉主干引起广泛肺栓塞，造成实验动物死亡。注栓时监测平均肺动脉压，使其达到45 mmHg，因为有资料表明急性肺栓塞时平均肺动脉压越高发展为慢性肺动脉高压的危险性越大。

总之，动物实验对于研究人类疾病的病因、发病机制、病理生理、临床治疗和药物试验等均有极其重要的意义。通过肺动脉高压动物实验，可了解并深入研究肺动脉高压疾病的发病机理，完善治疗方法。纵观目前现有的实验方法学，很多动物模型尚需进一步完善，许多观察指标的量化及标准化研究有待深入。