cDNA Met基因单核苷酸多态性与结直肠癌易感性关系的研究

武 昌，刘琳琳2*，高秀展3，徐 暖，李 强

(1临沂市河东区人民医院，山东 临沂 276000；2山东医专；3临沂市肿瘤医院)

结直肠癌(Coloretal cancer，CRC)是最常见的消化道肿瘤，目前临床尚无有效的标志物用于其早期诊断。循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)是源于肿瘤细胞的双链DNA片段[1]。研究证实，ctDNA所携带的肿瘤基因组信息与肿瘤组织具有良好的一致性，能克服常规肿瘤组织活检所无法突破的肿瘤异质性问题[2]。通过对外周循环样本进行ctDNA检测，从而为肿瘤原发灶的实时动态检测、复发灶基因组信息的转移过程提供便利，甚至为早期的诊断、疗效的评定，乃至预后的判断过程提供必要的协助[3]，也有助于靶向治疗适应症的评估，从而推进精准医疗的实施。本研究旨在探讨ctDNA MET基因与CRC发病之间的关系，以期为临床早期诊断做出有益的探索。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2015年1月-2018年6月在临沂市中心医院、临沂市肿瘤医院、河东区人民医院和山东医学高等专科学校附属医院治疗的CRC新发病例，共计50例纳入病例组，纳入标准：通过临床表现、血清标志物和组织比例学等检查，将其确诊为CRC；既往无其他恶性肿瘤史；调查前未行化疗和/放射治疗。同期收集来自上述医院的慢性肠炎患者50例，健康体检者50例作为对照，匹配标准：年龄(±5岁)和性别与病例组相匹配；过去没有其他病史。本研究获医院伦理委员会的批准。

1.2方法 准备3组研究者的血清，采用改良酚-氯仿抽提法提取其外周血循环DNA(cDNA)，采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测其含量。所选的定量标准品为人类基因组DNA，将其稀释为以下5个梯度：0.01、0.1、1、10、100 ng/μl。在此基础上对管家基因中的β-actin 400 bp和100 bp片段进行分析，并以其为混合血清中循环DNA表达量的代表。上游引物为5’-ATCGCTCACCGCAAATGC-3’，下游引物分别为5’-AATGCTATCACCTCCCCTGTGT-3’、5’-CATCTTGTTTTCTGCGCAAGTT-3’。探针序列为5’-FAM-CTAGGCGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA CCC-TAMRA-3’。模板为实验提取的血清DNA，对每个样本出现3次重复，最终以结果的平均值为准。反应体系：premix Ex TaqTM(2×)12.5μl，上游引物(10μM)0.5μl，下游引物(10μM)0.5μl，探针(10μM)0.25μl，模板DNA 10 ng，灭菌蒸馏水加至总体积为25μl。与此同时，以60℃ 30 s、95℃ 5 s和95℃ 1 min为发生反应的条件(FAM/Sybr)。

2 结果

2.1血清循环DNA的定量分析 CRC患者、慢性肠炎患者和正常对照组血清400 bp β-actin方面的平均含量分别为(48.00±10.35)、(9.37±1.86)和(7.81±1.67)ng/μl。三组比较具有统计学意义(F=685.79，P<0.01)；两两比较显示：慢性肠炎患者和正常对照组均低于 CRC患者(q=44.43，46.23；P<0.05)，二者之间差异不显著(q=1.79，P>0.05)。三组在血清100 bp β-actin方面的含量分别为(31.40±6.91)、(6.87±1.35)和(6.43±1.23)ng/μl，三组比较具有统计学意义(F=599.71，P<0.01)；两两比较显示：慢性肠炎患者和正常对照组均低于 CRC患者(q=42.03，42.79；P<0.05)，二者之间差异不显著(q=0.75，P>0.05)。

2.2CRC患者cDNA水平与临床病理特征 分别以患者血清中β-actin 400 bp、100 bp片段含量的中位数为参考依据，β-actin 400bp片段含量的中位数为43.9 ng/μl，100bp片段含量的中位数为27.1 ng/μl，400bp/100bp比值的中位数为1.78，将其为高、低两个表达组。其表达量的高低与患者的年龄、性别、TNM分期、肿瘤数目以及CEA的相关性并不显著。400bp/100bp比值的大小同样不会受到以下因素的显著影响：患者的性别、年龄、肿瘤数目、HBeAg、TNM分期及GGT。

3 讨论

目前，临床对CRC的早期诊断仍然缺乏有效的手段。有研究显示，包括肝癌、淋巴瘤、乳腺癌和肺癌等患者血清cDNA含量的完整水平相对较高[4]。本研究对结直肠癌患者、慢性肠炎患者和正常人群中β-actin400bp、100bp两种片段的含量进行了定量检测，结果发现，CRC血清中这两种片段的含量要高于慢性肠炎患者和正常对照组，而慢性肠炎患者和正常对照组之间并没有显著差异；CRC患者β-actin400bp、100bp两种片段的含量水平与其临床病例特征之间并没有相关性。