16S rRNA基因检测在假体周围感染诊断中的应用

塔拉提百克·买买提居马，王瑞，焦洋，刘恒，李翔，杨姗，曹永平

(北京大学第一医院，北京 100034)

随着人工关节置换的数量增加，关节置换术后并发症也越来越受到人们的重视。无菌性松动(aseptic failure，AF)和假体周围感染(prosthetic joint infection，PJI)是患者面临关节翻修手术的两大常见原因，但二者在临床上却时常较难鉴别。由于培养技术有限，很多不典型的PJI被误认为是AF。研究发现，PJI消耗的医疗资源和费用是AF的2.8倍[1]。2010年美国骨科医师协会有关PJI的指南指出[2]，虽然初次髋和膝关节置换术后假体周围感染的发生率仅为1%～4%，但是一旦发生，对患者来说就是灾难性的。PJI不仅增加患者痛苦，还带来巨大经济负担。PJI和AF处理原则也截然不同，区别主要在于假体再植入时机的选择和是否有必要把整个假体都取出，因此准确诊断PJI尤为重要。目前诊断PJI的金标准是假体周围组织或关节液中培养出细菌，但由于其敏感度和特异度均较低，导致相当大一部分患者漏诊或误诊。近年来分子生物学方法在PJI诊断中的研究和应用越来越多，但是对其有效性和实用价值仍存争议。本文针对16S核糖体RNA基因检测在PJI诊断中的原理和操作流程、优缺点和研究展望做一综述。

1 原理和操作流程

核糖体RNA(ribosome RNA，rRNA)对绝大多数原核生物的生存必不可少，其中16S rRNA在细菌及其他微生物的进化过程中高度保守，被称为细菌的“分子化石”。由于人体细胞中没有16S rRNA，所以极少发生人源性污染。在16S rRNA分子中同时含有高度保守的序列区域和高度变化的序列区域，高度保守区域可以作为广泛的探针检测细菌，而高度变化区域可用于鉴别菌种[3]。具体方法如下：首先根据高度保守区的碱基序列设计引物，将被检测微生物的16S rRNA基因片段进行扩增，测序获得该基因序列，再与生物信息数据库(如GenBank)进行比对和同源性分析，利用可变区序列的差异确定亲缘关系，从而对微生物进行分类鉴别。通常认为，16S rRNA基因序列同源性小于97%，即可认为属于不同的种；同源性小于93%～95%，可认为属于不同的属[3]。因此，16S rRNA在微生物临床检测方面，尤其是口腔科、妇产科、眼科等领域，用途越来越广泛。而16S rRNA基因检测在PJI诊断方面的应用起步比较晚，研究较少。

16S rRNA基因检测法诊断假体周围感染大致流程和注意事项如下：a)标本收集。所用标本一般为关节液或者假体周围组织，至少需要3个标本。收集标本后立刻送检实验室。为了减少体表菌群引起的标本污染，应避免使用浅表组织标本。同时，避免拭子法取标本，因其敏感性和特异度均较低。b)超声震荡处理假体周围组织标本。此步骤并非检测必需，但经超声震荡处理后的假体周围组织裂解液敏感性和特异性均显著高于普通假体周围组织标本。因此一般推荐超声震荡处理标本，以提高检测效率。c)基因提取。推荐自动化基因提取，从而降低交叉污染和节省人力。基因提取不充分或者浓度不够可能会导致假阴性，所以应该先扩增一段人的特定基因片段来测试提取基因的质量，一般选择人β-球蛋白基因[4]。d)基因扩增测序和分析。用BR-PCR或RT-PCR仪识别特定的16S rRNA基因片段并将其扩增，然后对扩增的片段进行基因测序。最终将检测出的基因序列跟基因数据库(例如GenBank)对比分析鉴别菌种。

若从几个不同患者中检测到同一个微生物，或者检测出的微生物为水(不动杆菌、假单胞菌)和皮肤(表皮葡萄球菌、丙酸杆菌)常见菌种时应考虑到污染可能。但是其中皮肤常见菌群有可能是污染，也有可能是假体周围感染的致病菌。

2 研究进展

Levine等[5]在1995年首次通过PCR技术检测到PJI相关细菌的16S rRNA基因片段，从而开辟了PJI诊断的新道路。应用通用的16S rRNA探针可以检测包括需氧菌、厌氧菌和分歧杆菌在内的几乎所有的原核生物[4]。据文献报道，临床上有明显感染证据的患者中仅有7%～39%的患者术后培养是阴性的，但16S rRNA基因测序能够检测出上述培养阴性标本中的细菌DNA[6]。

一般认为术前抗生素的应用和难养菌是导致培养阳性率低的可能原因，除此之外更重要的原因是假体周围常见病原菌往往在假体表面形成生物膜，从而进一步降低培养阳性率。跟游离细菌相比，由于生物膜内细菌运动性能降低，其新陈代谢和增殖会加快[7]。除此之外，生物膜不仅可以保护病原体免受抗生素和宿主免疫系统的攻击，还可以降低膜外细菌浓度，从而影响传统细菌培养阳性率[8]。Stoodley等[9]用扫描电镜或激光聚焦扫描显微镜证明了生物膜的存在。超声裂解法可以破坏生物膜从而释放更多病原体，因此可以提高病原体检出率。Rak等[10]对86例髋膝关节翻修患者的假体周围组织及其超声裂解液进行16S rRNA基因检测，结果显示未经超声处理的假体周围组织检测敏感性和特异性分别为76%和93%，经超声震荡处理的假体周围组织裂解液检测敏感性和特异性分别为95%和97%，从而首次用较大样本进行分子生物学方法证实超声裂解法能够提高假体周围感染检测的特异性和敏感性。因此临床上针对培养阴性的患者推荐超声震荡处理标本后再进行病原体检测。

Cazanave等[11]报道近期用过抗生素的患者标本中16S rRNA基因检测阳性率要显著高于培养阳性率。2014年Bémer等[12]在法国的一项多中心、大规模临床试验中通过16S rRNA基因检测发现葡萄球菌属是最常见的假体周围感染致病菌(占56%)，其中表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌比重几乎相等。链球菌占10%、丙酸杆菌占7%、芽孢杆菌占8%、混合感染占15%。

最近分子生物学方法在PJI诊断方面研究比较多，新技术也比较多。近期有研究表明通过分子生物学方法检测细菌特异性的耐药基因来对所检测致病菌进行药敏试验，比如mecA基因[13]。还有文献报道可以通过定量PCR来估算假体周围多重感染患者每一种病原体的细菌负荷[14]，但是目前该方法有效性仍需进一步验证。

3 优缺点和优化方案

16S rRNA基因检测可以弥补传统培养敏感性低的不足，尤其对于术前用过抗生素和难养细菌感染患者。但是其检测过程清洁要求高，很容易引起交叉污染，从而影响试验结果的可靠性。其原因包括：a)样品收集、运送过程中体表菌群和外界环境微生物的污染。b)基因提取过程中试管、移液管、实验员的手和衣物等均有可能造成交叉污染。c)基因扩增过程中也有可能受上一次扩增产物的交叉污染。尽管严格按照规定进行试验、一次性应用试管、移液管、水和反应物等，仍然彻底消除不了交叉污染。建议为了避免污染菌在试验过程中增殖，推荐使用无营养的生理盐水或者乳酸钠林格液[15]。分析试验结果时应考虑到污染的可能性，跟常见假体周围细菌对比，对最终结果进行综合取舍。

使用通用引物对16S rRNA基因进行检测的测序和对比分析过程很繁琐也很昂贵。而使用病原体特异性引物，检测细菌范围会受限，不属于引物分类单元的病原体会被漏检。新一代的焦磷酸测序法可以实现大规模、平行、快速、更精确的测序，并且成本也比传统的基因测序低[16]。16S rRNA基因检测另外一个缺点就是无法进行有效的药敏试验，但是随着药敏基因数据库的完善，分子生物学方法检测微生物的药敏也不再是个问题。

跟BR-PCR相比，病原特异性PCR具有更加快速、简便、可重复、可量化、敏感性更高等特点[17]，但是每次只能检测一种或者一类病原体。Bergin等[18]在一个样本量为64的研究中发现逆转录PCR(RT-PCR)诊断准确率为94%，明显高于传统培养和BR-PCR。RT-PCR更重要的优点是仅能够检测活的微生物，因此假阳性率低于BR-PCR。分子生物学方法的应用发现了很多难养菌，例如大芬戈尔德菌、惠普尔养障体、结核分歧杆菌和其他分歧杆菌[19]。除此之外，传统的培养法很难发现混合感染，因为优势菌群会抑制其他菌群，而生物分子学方法能够准确检测每个微生物的基因片段，发现传统培养不易发现的菌种。

针对假体周围感染目前大多数骨科医师都谨慎地选择二期翻修手术，其原因是细菌根除的不确定性。同时也有不少手术医师提倡一期翻修术，他们认为彻底、广泛的软组织和生物膜清除可以得到与二期翻修一样的手术效果。因此正确的病原体检测不仅对于指导抗生素应用尤为重要，而且对于把握假体再植入时机也很关键。据文献报道，二期翻修手术的成功率为73%～89%[20]。Dempsey等[21]报道全髋翻修术中取出的假体中有72%通过16s rRNA基因检测法检测到微生物，仅有22%通过传统培养检测出微生物。因此不应低估假体周围感染的发病率。

16S rRNA基因检测跟传统培养相比有更高的特异性和敏感性，具有检测迅速、范围广泛、可以发现多重感染、不受近期抗生素应用的影响等优点。同时该方法有容易污染、无法进行有效的药敏试验和价格昂贵等缺点，当临床医生遇到无法确定的试验结果时应该和微生物实验室的工作人员联系，一起分析试验结果，探讨是否有必要重复试验。收集标本前2周应该停用抗生素，否则会影响检测阳性率。如果患者在近期用过抗生素，则强烈推荐超声震荡联合16S rRNA基因检测法提高病原体检测率。

4 总结和展望

虽然16S rRNA基因检测在PJI诊断中有很高的灵敏度和特异度，并且不受近期抗生素使用的影响，但是不应完全替代传统细菌培养，推荐将其作为传统培养的补充，其适应证应仅限于临床上怀疑感染而培养阴性的患者。16S rRNA基因检测过程应该严格遵循实验规范，不重复使用试剂和容器，尽最大可能避免污染的发生。因此推荐将超声震荡和16S rRNA基因检测列入检验科常规检验项目，从而提高PJI诊断的准确性。

相信随着微生物全基因组的完善、PCR和基因测序技术的改进、更广谱的探针会问世，PJI病原体检测也会越来越准确。病原体特异性PCR的应用可以大大缩短试验时间，并且实现原地和实时发布监测结果。另外，分子生物学检测假体周围感染的经济效益方面现如今还没有相关研究，这也是一个可能会影响其未来应用前景的潜在因素。但随着芯片技术的发展，PJI常见病原体特异性探针集成的基因芯片或者微流体芯片将会给PJI的快速诊断带来前所未有的进步。