HPLC法同时测定复方木鸡颗粒中6种酚酸的含量

2019-02-10张敏陈晶晶陈玉琳杨帆张泽林门磊

中国民族民间医药·上半月 2019年12期

张敏陈晶晶陈玉琳杨帆张泽林门磊

【摘要】目的：建立反相高效液相色潽-雙波长法同时测定复方木鸡颗粒中没食子酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸6种酚酸类成分的含量。方法：采用WondaSil C18色谱柱（4.6mm × 250mm，5μm），以0.2%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）为流动相进行梯度洗脱，流速1.0mL·min-1，检测波长为 254nm和 325nm，柱温30 ℃，进样量10μL。结果：复方木鸡颗粒6种酚酸类成分在各自的线性范围内均呈良好的线性关系（r≥ 0.9990），平均加样回收率、精密度、重现性和稳定性均符合有关规定。样品中6种成分的平均含量在2.575～0.7668mg·g-1范围内。结论：试验建立的含量测定方法符合方法学验证要求，可用于复方木鸡颗粒中6种酚酸类成分的同时测定，为复方木鸡颗粒质量评价提供新的参考。

【关键词】复方木鸡颗粒;酚酸;含量测定

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）23-0028-05

Simultaneous Determination of Six Phenolic Acid Constituents in Compound Muji Granules by HPLC

ZHANG Min1 CHEN Jingjing1 CHEN Yulin1 YANG Fan1 ZHANG Zelin1 MEN Lei1， 2*

1. College of life science， Dalian Minzu University， Dalian 100050， China;2. Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization， Ministry of Education，（Dalian Minzu University）， Ministry of Education， Dalian 116600， China

Abstract：Objective To establish and validate the HPLC method for simultaneous determination of galic acid， vanilic acid， syringic acid， chlorogenic acid， coffeic acid and p-coumaric acid in compound muji granules. Method WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）column was adopted with mobile phase consisting of 0.2% phosphoric acid （A） and methanol （B） in gradient elution. The flow rate was 1mL·min-1， the column was kept at 30 ℃， and the detection wavelength was 260nm and325 nm. The injection volume was 10μL. Result The six chemical components were well separated and with good linear relationship over the respective range. The recoveries were between 95.3%～99.8%， and the RSD was less than 5.0%. The average content of six component in 6 batches compound muji granules were between 2.575μg·g-1 and 0.7668mg·g-1. Conclusion The method can be used for quality control of compound muji granules.

Keywords： Compound Muji Granules; Phenolic Acid; HPLC

复方木鸡颗粒是在民间药方“木鸡汤”的基础上开发研制而成的颗粒剂，由云芝提取物、山豆根、菟丝子、核桃楸皮等药材制成，具有治疗肝炎、肝纤维化、肝癌的作用[1-3]。作为最具有代表性的满族药，复方木鸡颗粒对肝病治疗机制独特，具有较大的研究价值。

复方木鸡颗粒自上市以来，由于其能特异性地抑制甲胎蛋白（AFP）升高，为治疗肝病开辟了一条新途径，因而吸引了越来越多的的关注。动物实验证明，复方木鸡颗粒对化疗药物有明显的减毒作用，且具有较强的抗癌活性，在临床上可作为一种化疗药物的减毒手段和抗癌免疫增强剂，可明显提高癌症患者的治疗效果[4-11]。复方木鸡颗粒现行质量标准无含量测定项，有文献分别对该制剂中苦参碱和金丝桃苷的含量进行检测，但多成分含量测定方面未见有研究报道[4，6]。课题组在前期研究中已鉴定或推断了复方木鸡颗粒甲醇提取物中36种主要化学成分，且对其制剂中的多糖和生物碱成分进行了含量测定，本研究建立HPLC法同时测定复方木鸡颗粒中没食子酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸6种成分含量的分析方法，并对不同批次复方木鸡颗粒的质量进行分析与评价，为复方木鸡颗粒的质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器岛津LC2010A液相色谱仪（配有Class-VP工作站、在线脱气机、输液泵、自动进样器、柱温箱和紫外检测器，日本岛津公司）;KQ 2200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;ME104 万分之一[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

1.2 试药对照品香草酸（802B021）、咖啡酸（110B022）、对香豆酸（112B023）、丁香酸（C100-79561）、绿原酸（1211D022）购自北京索来宝科技有限公司，对照品没食子酸（110780-201508）购于中国食品药品检定所，各对照品质量分数均大于 98%。乙腈、甲醇和磷酸（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）;纯净水（杭州娃哈哈集团）。复方木鸡颗粒由丹东药业集团提供（批号170-101，170201，170202，170203，170303，170304）。

2 方法与结果

2.1 对照品储备液的制备精密称取对照品没食子酸、香草酸、绿原酸、丁香酸、咖啡酸和对香豆酸适量，精密称定，用甲醇配制成质量浓度分别为2.001、1.030、1.080、1.050、0.204、0.025 g·L-1的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备取本品适量，研细，取粉末（过60目筛）约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，残渣再次置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声30min，放冷，滤过，合并两次滤液置蒸发皿中，水浴挥干，残渣加入甲醇适量使溶解，转移至5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件采用WondaSil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），以0.2%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）为流动相，洗脱梯度：0～15min，5%～20% B;15～20min，20%～30% B;20～40min，30%～40% B;40～45min，40%～5% B;45～50min，5% B。流速1.0mL·min-1，检测波长 254 nm和 325nm，柱温 30 ℃，进样量 10μL。

2.4 系统适用性试验精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液0.5mL，甲醇稀释定容至10mL，得没食子酸100.0mg·L-1、香草酸52.50mg·L-1、咖啡酸10.2mg·L-1、丁香酸54.00g·L-1、绿原酸51.50mg·L-1、对香豆酸1.25mg·L-1的混合对照品溶液。分别精密吸取该对照品溶液和“2.2”项下供试品溶液10μL，按照“2.3”项下色谱条件测定，记录色谱图。本实验条件下所测得的6个成分与相邻色谱峰的分离度良好，与其他组分分离完全，没食子酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸保留时间分别为11.3min、25.5min、27.0min、27.6min、28.8min和34.9min，色谱系统适用性实验符合含量测定要求，色谱图如图1所示。

2.5 线性关系考察精密吸取“2.1”项下对照品储备液各 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0mL，分别置10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成一系列浓度（1）的混合对照品溶液。按照“2.3”项下色谱条件进行测定，以各对照品质量浓度（X，mg·L-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，各成分回归方程和线性范围见表1。结果表明，6个成分在测定范围内线性关系良好。将混合对照品溶液逐步稀释，分别以 S /N = 3 和 S /N = 10時各对照品的质量浓度作为检出限（ LOD）和定量限（ LOQ），结果见表 1。

2.6 仪器精密度试验精密吸取供试品溶液（批号：170101）5μL，依“2.3”项下色谱条件进行测定，连续进样6次，记录峰面积，计算没食子酸、香草酸、丁香酸、绿原酸、咖啡酸和对香豆酸峰面积的RSD（n=6）分别为1.1%、0.46%、1.4%、1.5%、1.9%、0.74%、0.58%、1.1%、0.61%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性考察取批号170101样品粉末6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算含量。结果没食子酸、香草酸、丁香酸、绿原酸、咖啡酸和对香豆酸含量（n=6）分别为371.8、210.0、272.5、437.7、1.970、3.970mg·L-1，其RSD分别为0.84%、4.8%、4.5%、4.0%、4.9%、4.2%、2.1%，表明重复性良好。

2.8 供试品溶液稳定性试验取同一份供试品溶液（批号：170101），分别于配制后0、6、12、24h进样测定，结果没食子酸、香草酸、丁香酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸峰面积的RSD（n=6）分别为1.8%、3.1%、2.7%、4.9%、4.2%、4.4%和3.1%，表明供试品溶液在 24h内稳定。

2.9 加样回收率试验精密称取已知含量的同一批次的复方木鸡颗粒样品（170101） 9份，每份1.0g。精密称取没食子酸、香草酸、丁香酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸对照品适量，加甲醇分别制成没食子酸（0.8g·L-1）、香草酸（0.4g·L-1）、丁香酸（0.4g·L-1）、绿原酸（0.4g·L-1）、咖啡酸（0.008g·L-1）、对香豆酸（0.005g·L-1）的混合对照样品。取0.8、1.0、1.2mL各3份，加入9份样品中。按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3”项下的色谱条件进行含量测定，计算 6种成分的平均回收率及RSD，结果见表2。6种待测成分的平均回收率在95.3%～ 99.8%，RSD 均小于5.0%，表明方法的准确度良好。

2.10 样品含量测定分别取不同批号的复方木鸡颗粒按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，以外标法计算6个酚酸类成分的含量，结果见表3。

3 讨论

复方木鸡颗粒提取物中成分复杂，本实验首先考察不同比例的甲醇和乙醇为提取溶剂，以及超声和回流提取方法对方剂的提取效率，结果表明甲醇超声提取两次的各被测成分色谱峰峰面积最大，故采用甲醇溶液作为提取溶剂。

流动相的选择：由于复方中药材的化学成分复杂，故选择梯度洗脱系统。被测成分均为有机酸类物质，为了防止色谱峰拖尾，故在流动相中加入酸。考察甲醇-水、乙腈-水2种溶剂系统，以及流动相中加入不同比例的甲酸、乙酸、磷酸、醋酸铵的分离效果，结果显示甲醇-0.2%磷酸水溶液系统基线平稳，峰型较好，分离效果最佳。

波长的选择：采用 DAD二极管阵列检测器在200 ～ 400nm范围内扫描各对照品溶液的紫外吸收，没食子酸、丁香酸和咖啡酸的最大吸收波长为270nm，香草酸为260nm，绿原酸为247nm和325nm，对香豆酸为313nm。为保证各待测成分能得到较好的响应且分离效果最佳、干扰最少，最终选择254nm为没食子酸、香草酸和丁香酸的检测波长;325nm为绿原酸、咖啡酸和对香豆酸的检测波长。

复方木鸡颗粒各味药材化学成分复杂，主要含有多糖、生物碱、酚酸类和黄酮类等成分。其中酚酸类成分药理作用广泛，如抗炎症反应、抑制血小板聚集、抗血栓、抗氧化、诱导肿瘤细胞凋亡等。前期研究中从复方木鸡颗粒提取物中检测到生理活性较强、含量较高的绿原酸、没食子酸、丁香酸、对香豆酸和咖啡酸。为弥补现行方剂质量标准的不足，本实验筛选该6种酚酸类成分作为检测指标，供试品含量测定的结果表明，10批复方中没食子酸和绿原酸的含量质量分数均值为0.08%，香草酸和丁香酸的含量质量分数小于0.06%，咖啡酸和对香豆酸的含量质量分数均不足0.001%。复方木鸡颗粒中的酚酸類成分多来自核桃楸皮和菟丝子，咖啡酸和对香豆酸的含量不足0.001%，因此并不适用于复方木鸡颗粒质量的评价指标，而没食子酸、绿原酸、香草酸和丁香酸的含量可用于该方剂的质量控制。本研究基于双波长法对复方木鸡颗粒中6个酚酸类成分含量的同时测定，为复方木鸡颗粒质量评价提供新的参考。

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