宿主miRNA-2127靶向p53促进禽流感病毒H9N2亚型体外复制的分子机制

张玉霞 袁小远 杨金兴 孟凯

摘要：为研究鸡体内miRNA-2127对低致病性禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）H9N2复制的影响，本研究将化学合成的gga-miR-2127模拟物和抑制剂分别转染DF-1细胞，接种H9N2亚型病毒，检测细胞中病毒含量变化，发现gga-miR-2127能够显著促进病毒的复制。为探索其中的分子机制，用生物信息学软件预测gga-miR-2127的调控位点位于p53基因mRNA的3′UTR区，并用双荧光素酶报告系统对其靶向关系进行了验证。荧光定量RT-PCR法和Western blot试验表明，gga-miR-2127过表达时p53的mRNA水平不变而p53蛋白表达水平降低，细胞天然免疫机能下降。据此推测gga-miR-2127促进H9N2复制的分子作用机理是在p53基因的mRNA转录后，通过gga-miR-2127与其mRNA的3′UTR区结合，抑制p53蛋白的翻译从而抑制抗病毒作用和细胞的天然免疫机能。

关键词：H9N2亚型禽流感病毒;gga-miR-2127;分子机制

中图分类号：S852.65+7 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2019）12-0091-05

Abstract To study the effect of miRNA-2127 on the replication of low pathogenic AIV （avian influenza virus） subtype H9N2 in vitro， chemically synthesized gga-miR-2127 mimic and inhibitor were transfected into DF-1 cells inoculated with H9N2 subtype， and the changes of virus content in cells were detected. It was found that gga-miR-2127 could significantly promote the replication of AIV virus. In order to explore the molecular mechanism， the regulatory site of gga-miR-2127 was predicted as 3′UTR region of mRNA of p53 gene by bioinformatics software， and the targeting relationship was validated by double luciferase reporting system. Fluorescence quantitative RT-PCR and Western blot assay showed that the mRNA of p53 gene remained unchanged while the expression of p53 protein decreased under the condition of overexpressing gga-miR-2127， and the innate immune function of cells decreased. It was speculated that the molecular mechanism of gga-miR-2127 promoting H9N2 replication was through inhibiting the translation of p53 protein by binding with the 3′UTR region of p53 gene after transcription， so the antiviral effect and the realization of cell innate immune function were inhibited.

Keywords H9N2 subtype avian influenza virus; gga-miR-2127; Molecular mechanism

H9N2型低致病性禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）自1994年在廣东省首次分离到以来，一直是危害我国鸡群的主要低致病性AIV亚型。该病毒不仅能引起禽呼吸道系统和生殖系统疾病，造成蛋禽产蛋率下降，肉禽生长缓慢，同时引起患病机体免疫抑制并激发其他病原微生物混合感染，造成家禽死亡[1]。

AIV感染家禽后，病毒与机体免疫系统的互相作用直接关系到家禽的预后，研究探索如何提高机体抗病毒的免疫机能，调控感染家禽向健康方向发展非常必要。p53蛋白是一种分子量为53 kD的磷酸化蛋白，在机体上皮和造血细胞中广泛表达，除了作为热门的肿瘤抑制蛋白被大量研究之外，p53蛋白在抗病毒[2]及增强宿主的先天及获得性免疫力[3]方面也有重要作用。因此，如何激活p53蛋白表达，使其发挥抗病毒作用，是一项值得深入研究的课题。2006年，Voorhoeve等[4]首次发现miRNA参与p53信号通路，是p53信号通路调控网络中关键的分子。近几年，miRNA在人类抗病毒治疗中已开展了广泛的研究。目前鸡体内已发现miRNA几千种之多，但是对其功能却知之甚少。本研究根据前期研究中H9N2感染DF-1细胞后miRNA的差异表达，筛选了显著升高的miRNA-2127，观察其对p53蛋白的影响以及与H9N2病毒复制的关系，并试图阐明背后的分子调控机制，以期为抗击禽流感病毒提供更深层次的解读，为开发更广谱的抗病毒基因药物及寻找新抗病毒靶点奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 毒株和试剂

病毒RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，一步法RT-PCR试剂盒，购自大连TaKaRa公司;转染试剂Iipofectamine 3000，购自Invitrogen 公司;pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体及检测试剂盒，购自Promega公司;兔抗p53蛋白抗体，购自Sigma公司;DMEM培养基，opti-DMEM培养基，犊牛血清，均为Gibico产品。

H9N2亚型1402毒株，由华南农业大学动物医学院惠赠;DF-1细胞，为本实验室保存。

gga-miR-2127分子的模拟物与抑制物，购自广州市锐博生物科技有限公司。模拟物能模拟细胞内成熟miRNA的高水平表达，以增强内源性miRNA的调控作用;抑制物可以特异地与成熟miRNA结合而抑制其作用，削弱细胞中miRNA导致的基因沉默效应，从而进行miRNA功能缺失性研究。

1.2 gga-miR-2127对H9N2病毒复制的影响试验

预铺DF-1细胞于24孔板，转染前细胞密度达到50%以上。按Iipofectamine 3000说明书用opti-DMEM培养液分别稀释gga-miR-2127模拟物与抑制物和转染试剂，二者混合置室温孵育20 min，分别转染DF-1细胞，24 h后接种H9N2禽流感病毒，1 h后弃去病毒液，加含2%犊牛血清的DMEM培养液37℃继续培养。于病毒感染24、36、48 h后分别收集细胞各3孔。按照病毒RNA提取试剂盒说明书提取细胞内的病毒RNA，利用反转录试剂盒将其转为cDNA，-80℃保存备用。参考GenBank发布的多株H9N2禽流感病毒M基因序列，设计特异性引物（H9N2-M-F/H9N2-M-R）（表1），由北京六合华大基因科技有限公司合成，荧光定量PCR法检测细胞内H9N2病毒含量，并同步设立gga-miR-2127抑制物转染组、NC对照组（转染时只加等量opti-DMEM培养液）。

1.3 gga-miR-2127调控H9N2病毒复制的分子机制分析

1.3.1 gga-miR-2127靶基因预测与验证 利用生物信息学方法（TargetScan、PicTar、miRanda），并参考miRNA数据库（http：//www.mirbase.org）分析预测gga-miR-2127的靶基因及其结合位点。

预测发现，gga-miR-2127的靶基因结合位点位于p53基因mRNA的3′UTR区，为对此靶向关系进行验证，通过全基因合成方法合成了该结合位点的野生型与突变型模板，并分别将其克隆到pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体中，构建该结合位点的野生型与突变型重组双荧光素酶报告质粒。将野生型报告质粒、突变型报告质粒分别与gga-miR-2127共转染DF-1细胞，同步设立阴性质粒与gga-miR-2127共转染DF-1细胞对照组，利用双荧光素酶检测试剂盒分析各组中荧光素酶活性的变化。

1.3.2 gga-miR-2127分别对p53在基因水平和蛋白水平上表达的影响检测 将gga-miR-2127转染DF-1细胞，接种H9N2亚型病毒1402毒株，在接种24、36、48 h后用TRIZOL收集细胞，-80℃保存备用。参考GenBank发布的p53基因序列，设计特异性荧光定量PCR引物（p53-F/p53-R）（表1）。TRIZOL法提取不同时间点细胞中的RNA，荧光定量分析不同时间点细胞内p53基因mRNA的表达水平。

收集转染过gga-miR-2127并接种H9N2 亚型病毒的DF-1细胞培养物，采用Western blot方法[5]检测p53蛋白在细胞中的表达水平，同步设立未转染gga-miR-2127的DF-1感染H9N2 亚型病毒的对照组。

1.3.3 gga-miR-2127对多种细胞因子、炎性因子及抗病毒天然免疫基因表达的影响检测 通过NCBI中Primer-BLAST工具对干扰素（IFN-α）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白介素（IL-1β）、抗病毒因子OAS（2′， 5′-oligoadenylate synthetase）基因及內参基因（β-actin）设计引物（表1），检测不同时间内转染gga-miR-2127模拟物和抑制物对上述抗病毒天然免疫基因及细胞因子的影响。

2 结果与分析

2.1 gga-miR-2127对H9N2病毒复制的影响

对DF-1细胞内的H9N2 亚型病毒RNA进行荧光定量PCR检测，发现随着PCR循环次数的增加，荧光强度也增强，gga-miR-2127模拟物能够促进病毒的复制，与抑制物相比有显著差异，36 h时差异最显著（图1）。

2.2 gga-miR-2127靶基因的生物信息预测及靶向功能验证

生物信息法预测gga-miR-2127与p53 基因mRNA的3′UTR区结合，结合位点位于3′UTR区369 ～ 375 bp之间。根据该结合位点构建了野生型与突变型重组双荧光素酶报告质粒，并将它们分别与gga-miR-2127共转染DF-1细胞后监测荧光素酶活性变化。结果显示，共转染野生型报告质粒与gga-miR-2127的DF-1细胞组（gga-miR-2127+野生型）与只转染野生型报告质粒组（NC+野生型）相比荧光素酶活性显著降低（P<0.05），而突变型报告质粒与gga-miR-2127共转染组（gga-miR-2127+突变型）较gga-miR-2127+野生型组显著提高（P<0.05），gga-miR-2127+突变型组、NC+突变型组和NC+野生型组之间差异不显著（P>0.05）（图2），说明gga-miR-2127能够靶向调控p53基因。

2.3 H9N2感染对p53活性的影响

荧光定量PCR检测结果显示转染gga-miR-2127模拟物并接种H9N2病毒的DF-1细胞中p53的mRNA表达水平与转染gga-miR-2127抑制物组及空白对照组之间差异不大，说明gga-miR-2127未对p53基因转录产生影响。

采用Western blot法分析两组细胞中p53蛋白的表达含量，结果显示，转染gga-miR-2127模拟物组较空白对照组DF-1细胞中的p53蛋白表达量降低（图3）。

2.4 gga-miR-2127对多种细胞因子的影响

通过对细胞培养物中TNF-α、IL-1β及OAS、IFN-α中的mRNA水平进行免疫荧光PCR定量分析，结果显示，gga-miR-2127模拟物转染组中TNF-α、IL-1β 含量高于gga-miR-2127抑制组，而OAS、IFN-α则明显低于gga-miR-2127抑制物转染组和空白对照组（图4）。

3 讨论与结论

miRNA是一类长度在21 ～ 25个核苷酸组成的内源性单链非编码小RNA，广泛存在于人与各种动植物体内。人体内的miRNA在抗击口蹄疫病毒、H1N1流感病毒等多种病毒的过程中起到干扰病毒复制和调控病毒基因表达、激活干扰素等抗病毒基因的作用[6，7]。本研究结果显示，gga-miR-2127的模拟物显著增强了体外H9N2病毒的复制，且具有时间依赖性，在病毒接种后36 h差异最显著。因此，gga-miR-2127可促进H9N2禽流感病毒的体外复制。

miRNA在基因调控网络中有重要地位，据预测生物体内1/3的mRNA受miRNA调控。其调控方式主要有两种：一是与mRNA直接完全互补，引起靶基因mRNA的降解[8];二是通过与靶基因的3′UTR之间形成不完全碱基互补，诱导靶基因mRNA降解或阻遏其翻译[9]。基于miRNA靶基因的预测规则，人们开发了相应的在线软件，也建立了完善的试验方法验证miRNA靶基因。本研究预测gga-miR-2127的靶基因位点位于p53基因mRNA的3′UTR区。一般条件下，miRNA跟NC对照相比，野生型载体报告荧光有所下调，则认为miRNA对报告基因有调节作用[10]。本研究共转染结合位点的野生型+gga-miR-2127组较共转染结合位点的野生型+NC对照组和突变型+gga-miR-2127组荧光素酶活性均明显降低，说明gga-miR-2127确实与p53基因mRNA的3′UTR区结合，可靶向调控p53基因。

对gga-miR-2127转染后DF-1细胞中的p53基因的mRNA含量进行检测发现，gga-miR-2127含量对其无显著影响，而p53蛋白表达与gga-miR-2127呈负相关，转染gga-miR-2127模拟物组p53蛋白的表达含量较未转染组表达明显降低，表明gga-miR-2127负调控p53蛋白的表达。据此推测，gga-miR-2127是在p53基因转录后负调控蛋白表达。因此，gga-miR-2127与miR-1285[11]、miR-125a[12]、miR-33[13]和miR-504[14]等相同，均可直接作用于p53基因mRNA的3′UTR区，从而在转录水平上负调控p53蛋白的表达。

病原微生物感染宿主后，激活宿主的天然免疫应答，诱导产生多种炎性因子和抗病毒基因抵抗微生物损伤。TNF-α是一种肿瘤坏死因子，IL-1β是体内常见的炎性细胞因子，本研究表明随着细胞内H9N2病毒含量的增加，gga-miR-2127模拟物转染组中二者相对于gga-miR-2127抑制组和NC对照组显著增加。OAS为抗病毒天然免疫基因，IFN-α是具有抗病毒、调节免疫功能活性的蛋白质，因此本试验选取在机体抗病毒天然免疫中占重要地位的二者为代表研究gga-miR-2127转染后细胞免疫机能的变化。本研究中，二者模拟物转染组随p53蛋白下降呈现抑制状态，表明二者均受p53蛋白转录激活参与调控网络，这与Ouyang[15]、Zuniga[16]等研究基本一致。

由于宿主体内miRNA数目繁多，一个miRNA可调控多条mRNA，病毒利用这些宿主细胞的miRNA通路可促进病毒在体内的复制，同时病毒本身也可编码miRNA，并利用这些miRNA靶向结合宿主或病毒基因以逃避抗病毒反应。因此，病毒与miRNA的調控关系是复杂的。

综上，gga-miR-2127体外过表达能够促进H9N2亚型病毒体外复制，其可能的分子机制是在p53基因的mRNA转录后，通过与其mRNA的3′UTR区结合，抑制p53蛋白的翻译从而抑制其抗病毒作用。因此家禽H9N2疫情感染时，通过对gga-miR-2127进行调控，以此发挥p53蛋白的抗病毒能力及提高机体先天免疫力或许是治疗H9N2疫病的新途径。

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