应用UTMD技术联合脂质体转染介导人肝癌细胞表达miRNA-122的研究

李艳，罗栩伟，朱冬梅，杨姣，张英娟，张慧，陈思佳，刘刚，刘学彬

(川北医学院第二临床医学院，南充市中心医院，四川 南充 637000)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，占原发性肝癌的75%～85%，具有起病隐匿、进展快、易复发和预后差的临床特点[1-2]。虽然肝癌的治疗有了很大的提高，但由于耐药性和复发，死亡率仍然很高，中国每年约有383 000人死于肝癌。miR-122是肝脏含量最丰富的肝特异性微小RNA，占肝脏miRNAs的70%，其表达下调参与了肝癌的发生发展[3-5]。

超声靶向微泡破坏(ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)是指利用超声波和携带靶基因的微泡来实现靶向基因的转染，近年来迅速发展起来的一种新的基因治疗方法[6-7]。它可以通过产生超声波来提高细胞摄取基因的能力，从而暂时提高细胞和毛细血管的通透性[8]。质粒具有高特异性、高敏感性、瞬时表达水平、低耗费和低免疫原性等特点，是UTMD研究的首选载体[9]。Lipofectamine2000是研究中常用的阳离子脂质体转染剂，但其介导质粒转染的效率有待提高[10]。微泡造影剂作为一种无创性载体携带质粒，在超声介导下可显著提高细胞基因转染率和细胞生存率，但微泡不能携带足够数量的基因[11-12]。考虑到脂质体转染和UTMD的优缺点，本研究小组推测这两种方法的结合将会产生更好的转染效果。本研究以肝癌细胞株HCCLM3为对象，构建pLMP-miR-122表达载体，应用UTMD技术联合脂质体介导miRNA-122在HCCLM3细胞中的表达，并探索miRNA-122对人肝癌细胞HCCLM3的生物学行为的影响，为肝癌的诊断和治疗提供新的方向和靶点。

1 材料与方法

1.1 实验仪器和试剂

人肝癌细胞系HCCLM3(购自武汉中国细胞研究中心)；无血清高糖细胞 DMEM 培养基(Hyclone)；100 U/mL penicillin和100 μg/mL streptomycin；磷酸盐缓冲液(PBS)(HyClone)；胎牛血清(FBS)(HyClone)；0.25%胰酶(HyClone)注射用六氟化硫微泡(SF6；Bracco Suisse SA，Manno，Switzerland)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher)；CCK-8试剂盒(吉凯基因)；总RNA提取试剂盒(TIANGEN)；细胞培养箱(Thermo Fisher)；核酸扩增仪(T100，Thermo)；BIO-RAD实时荧光定量PCR仪(ICYCLER IQ5)；核酸微量分光光度计(Eppendorf)；旋涡震荡器(Eppendorf)；高低速离心机(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 质粒构建 根据文献[13]构建pLMP-miR-122质粒。利用生物信息学分析pre-miRNA-122启动子片段并扩增，经测序并序列比对分析后进行转染。

1.2.2 细胞培养、分组和转染 (1)细胞培养。人肝癌细胞株HCCLM3培养于DMEM培养基中，内含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素。将HCCLM3细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养至对数生长期进行实验，隔2～3 d传代1次，细胞消化液为0.25%的胰酶。(2)细胞分组和转染。转染前1 d将细胞接入6孔板，24 h内待细胞生长密度达到50%～60%即可转染,参照脂质体 LipofectamineTM 2000说明书转染。将人肝癌细胞株HCCLM3分组如下：A组(空载组)：转染空载质粒；B组(脂质体+质粒组)：1 mL培养液加入10 μL Lipofectamine 2000和4 μg pLMP-miR-122质粒；C组(超声微泡+质粒+超声辐照组)：0.9 mL细胞培养液中加入100 μL SF6微泡以及4 μg pLMP-miR-122质粒，然后进行超声辐照，D组(脂质体+超声微泡+质粒+超声辐照组)：0.9 mL细胞培养液中加入10 μL Lipofectamine 2000、100 μL SF6微泡以及4 μg pLMP-miR-122质粒，然后进行超声辐照。超声辐照条件为：2.0 MHz(超声造影模式)、机械指数(MI)为 0.28，超声辐照40 s。辐照结束5 h后更换为正常培养液，继续培养。

1.2.3 荧光定量PCR技术检测基因表达水平 按照总RNA提取试剂盒说明书，提取转染48 h的各组细胞总RNA，经逆转录得到cDNA。应用荧光定量PCR(QRT-PCR)技术检测各组细胞pre-miRNA-122表达水平。引物序列见表1，U6为内源性对照。反应条件为：95 ℃预热15 min；94 ℃，15 s；55 ℃，30 s；70 ℃，30 s；共35个循环。每个反应孔的荧光信号达到设定阈值时的循环数即为Ct值。对检测得到的miRNA的CT值以相对定量的方法进行数据分析：miRNA的相对表达量用2-ΔCt来计算。每个基因重复反应3次，进行独立实验3次。选择空载组、以及转染效率最高的细胞组进行后续试验，记为con-LM3组、miR-122-LM3组。

表1 引物序列表

1.2.4 CCK-8检测各组细胞活性 将con-LM3组、miR-122-LM3组细胞接种到96孔板中(104/孔)，每组各作5个复孔，贴壁24 h后，即可开始加入10 μL CCK-8试剂孵育2 h后，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(OD值)，作为第1天的细胞活性。共检测第1～5天的细胞活性。记录每组5孔的数据并取均数作图。细胞活性以平均OD值表示。

1.2.5 体外迁移和侵袭实验 (1)划痕实验：通过Wound healing assay观察con-LM3组、miR-122-LM3组细胞的迁移情况。培养2 d至细胞融合度为80%左右，血清饥饿16 h，以10 μL枪头划痕，0 h、24 h显微镜下拍照，观察细胞的迁移能力并计算细胞迁移率。细胞迁移率的计算公式=[迁移距离D(0 h)-迁移距离D(24 h)]/迁移距离 D(0 h)。 (2) Transwell 实验：通过Transwell实验分析两组细胞的侵袭能力，使用直径6.5 mm的聚碳酸酯过滤膜(8 μm孔径，BD Biosciences)。细胞(5×104)接种于无血清培养基上室，下室中加入含有20%FBS的DMEM培养基600 μL。孵育48 h后，取出小室，用棉棒拭去上室残留细胞，小室下面穿膜的细胞经4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，PBS洗去残留结晶紫溶液，小室室温晾干后置于显微镜下随机观察6个视野并拍照，计数穿膜细胞数。侵袭实验时，在上室提前加入50 μL基质胶(1∶6，美国BD Biosciences)，待胶凝固后加入细胞悬液，其他步骤同迁移。

1.2.6 CCK-8检测对化疗敏感性的影响 将对数期的con-LM3组、miR-122-LM3组细胞各均分到96孔板中(104/孔)，每组各5个复孔，贴壁24 h后，分别加入6.25、12.5、25、50、100 μg/L顺铂培养，于加药后48 h应用CCK-8法检测细胞OD值，方法同前。(OD正常组-OD药物组)/(OD正常组-OD空白组)×100%=细胞抑制率。细胞存活率=1-细胞抑制率，以细胞存活率绘图。IC50为细胞抑制率等于 50%时的药物浓度。

1.2.7 蛋白印迹(Western blotting)检测抗凋亡蛋白Bcl2的表达 将con-LM3组、miR-122-LM3组细胞均分到六孔板中，长至70%～80%融合后使用裂解液将细胞裂解提取蛋白样品，BCA蛋白定量试剂盒进行定量。取等量蛋白样品进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转移至醋酸纤维膜(NC)膜上，5%脱脂奶粉常温封闭1 h，加一抗4 ℃过夜，洗膜后加二抗孵育1 h。一抗(均购自美国Abcam公司)包括：兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，1∶2 000)，兔抗人Bcl2(1∶500)。常规增强化学发光法曝光、扫描成像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组细胞转染效率

通过QRT-PCR技术检测五组细胞的pre-miRNA-122表达水平，提示D组细胞的miR-122表达水平高于其他各组细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)；而B、C组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2 miRNA-122抑制HCCLM3增殖

与con-LM3组比较，miR-122-LM3组细胞生长明显受到抑制(P<0.05)。并且，我们发现miR-122-LM3组细胞Bcl2蛋白表达明显下调，与con-LM3组细胞相比(P<0.05)。见图2。

2.3 miRNA-122抑制HCCLM3体外侵袭和迁移能力

划痕实验结果显示，con-LM3组和miR-122-LM3组细胞的24 h迁移率分别是52%和20%，表明过表达miR-122后细胞迁移明显受到抑制，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验结果显示，miR-122-LM3组平均视野细胞数明显少于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。 见图3A、图3B和表2。

组别细胞迁移细胞侵袭con-LM3组(n=3)178±12.493±8.52miR-122-LM3组(n=3)31±6.222±5.12

2.4 miRNA-122对HCCLM3细胞耐药性的影响

不同浓度的顺铂作用细胞48 h，miR-122-LM3组细胞对顺铂的敏感性高于con-LM3组(P<0.05)，miR-122-LM3组的IC50是(24.12±1.33)μg/L，而con-LM3组细胞的IC50是(52.12±4.96)μg/L。见图4。

3 讨论

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约21～22个核苷酸序列的单链非编码小RNA，在肝脏中表达丰富，其通过调控特定的靶基因表达在新陈代谢、发育、凋亡、分化、病毒感染及肿瘤发生等过程中发挥重要作用[14]。研究[15]表明，miRNAs表达水平的变化可能是肝炎、肝癌发生的关键机制。其中miRNA-122是正常肝组织特异性高表达的miRNA，而在肝癌细胞中的表达显著下调[16]。并且，miRNA-122调控调节胆固醇代谢和促进肝细胞的终末分化，它的缺失损伤正常的肝功能，促进肝癌患者的发病和死亡[17-18]。此外，miR-122的表达水平与 HCC 患者的预后也密切相关，表达下调能够促进肿瘤转移和进展[19]。miR-122表达受抑制是HCC的特征，表现为侵袭能力增强、肿瘤复发和患者生存时间减少，因此miR-122 表达缺失可诱发肝癌细胞获得侵袭表型。

常用的基因转染方法(如病毒、脂质体等)不适用于体内基因转染。病毒介导的基因转染具有潜在的副作用，而脂质体介导的基因转染在体内的效率极低。目前，已有大量研究[20-23]认为UTMD能有效介导基因转染，具有安全、实用、靶向性强等优点，成为基因治疗的主要发展趋势之一。UTMD产生的空化效应是UTMD与脂质体结合介导基因转染的主要机制，也是提高脂质体转染效率的主要原因。并且，新型超声微泡造影剂的出现进一步提高了空化效应和在体外裸DNA转染基因的表达[24-25]。本研究通过联合UTMD技术和脂质体转染miRNA-122至HCCLM3细胞使其miRNA-122表达上调，通过RT-qPCR鉴定发现转染后的HCCLM3细胞可以稳定表达miRNA-122。此外，本研究结果显示，与其他方法比较UTMD技术结合常规脂质体转染方法可以增强转染效率。这与Wang等[26]联合UTMD和脂质体介导乳腺癌细胞增敲减强异黏蛋白(MTDH)表达效率的结果一致，这将为体内基因治疗奠定基础。

与此同时，本研究结果揭示过表达miRNA-122可以抑制HCCLM3细胞的增殖、侵袭能力，过表达miR-122后抗凋亡蛋白Bcl2表达下调。Bcl-2是能够阻止细胞色素c从线粒体释放到细胞质，从而抑制细胞凋亡的抗凋亡因子[27]。此外，顺铂是目前临床上频繁使用的一种具有广谱作用的抗肿瘤药物，但对 HepG2 细胞作用过程中存在的耐药性[28]。Wang等[29]的研究揭示miR-122水平可能是肿瘤细胞抗化疗的关键因素，于是本研究探索了miRNA-122是否参与肝癌细胞耐药，结果显示miRNA-122可以增加对顺铂的敏感性。虽然，本研究提示肝miR-122可作为抑制肿瘤发生的促凋亡因子，然而，其具体机制以及miR-122如何被调控表达的研究还需进一步探索。

综上，联合UTMD技术和脂质体成功转染人肝癌HCCLM3细胞过表达miRNA-122，miRNA-122上调后可以明显抑制HCCLM3增殖、迁移和侵袭能力，并且miRNA-122上调后细胞对化疗药物的敏感性增加。本结果有望为肝癌的诊断和基因治疗提供新的治疗靶点和新的思路。