慢性乙型肝炎与调节性T细胞研究进展*

杜科业，杨东亮，刘 嘉

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球最常见的传染病之一，是严重影响人类健康的公共卫生问题。据世界卫生组织最新统计，全球约有2.57亿慢性HBV感染者。慢性乙型肝炎病情反复迁延，可致肝纤维化，并逐步进展为肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[1]。对于慢性HBV感染，抗病毒治疗可以有效控制病毒复制，改善绝大多数患者的临床状况，并降低死亡率和发病率。但现在的抗病毒药物存在停药后反弹等问题，大多数慢性乙型肝炎患者需要接受终生治疗，较难实现慢性HBV感染的功能性治愈。特异性T细胞活化和应答在清除HBV肝内感染方面发挥着关键作用[2]。急性自限性HBV感染患者体内通常可检出针对多个HBV表位的特异性CD8+T细胞，去除HBV急性感染黑猩猩体内CD8+T，则HBV难以被清除而导致感染持续；在慢性HBV感染患者体内，CD8+T细胞应答缺失或减弱，处于功能性耗竭状态[3]。调节性 T细胞（regulatory T cell，Treg）是 CD4+T细胞中的一种特殊亚群，可以抑制或者下调效应性T细胞的功能和增殖，从而维持免疫耐受状态或抑制自发性免疫的产生[4]。Treg细胞在效应性T细胞功能损伤及建立慢性HBV感染中发挥着重要作用。本文就Treg细胞的发现、分类及其在HBV感染过程中发挥的作用加以介绍。

1 Treg细胞的发现

Gershon及其同事在上世纪70年代就提出了“T细胞介导免疫抑制”的概念[5]，但直到80年代，才在小鼠和大鼠的自身免疫性疾病模型中发现了一群特殊的T细胞亚群，这群细胞在阻止自身免疫发生中发挥着重要作用[6]。然而，由于缺乏特异性的细胞标志物，关于这群特殊的T细胞亚群的研究推进受到了影响。90年代，Sakaguchi et al在将敲除了CD4+CD25+的T细胞过继转输到裸鼠体内后诱发了自身免疫性疾病的发生[7]。相反地，重新补充CD4+CD25+T细胞可以有效抑制自身免疫性疾病的发生和发展。最终，这群结构性表达白细胞介素 2（interleukin-2，IL-2）受体 CD25分子的 T细胞亚群被命名为“Treg”。不久后，相似的结果在人体实验中也得到了证实[8]。

但值得注意的是，Treg很难十分有效地与效应T细胞进行区分，这是由于效应T细胞同样可以表达CD4和CD25，甚至在CD25高表达的T细胞群中依然包含有50%刚活化的T细胞。因此，CD4和CD25两种标志物并不足以将Treg从常规T细胞中区分出来，特别是与效应T细胞相区分。随着对Treg研究的深入，FoxP3被进一步证实为决定CD4+CD25+Treg细胞表型及功能的主要调节分子[9]，研究表明当FoxP3的表达受损或者下调时，Treg抑制性功能也会受到影响，逆转FoxP3的表达后这群细胞会重新获得调节性功能。目前，Treg被认为主要从初始 CD4+T细胞分化而来，CD4、CD25和FoxP3是其最主要的标志物[10]。

2 Treg细胞亚群

根据发育机制的不同，目前Treg主要分为两个亚群：即自然调节性 T细胞（natural Treg，nTreg）和诱导型调节性T细胞（inducible Treg，iTreg）。nTreg来源于胸腺细胞，在胸腺内分化、发育、成熟，而iTreg可由外周初始T细胞分化而来，或在持续小剂量的抗原刺激下由已分化的T细胞发展而来[11]。

2.1 nTreg nTreg作为CD4+T细胞的一个重要亚群，在胸腺中发育，并可以从胸腺释放至外周血中发挥作用，迁移出胸腺的nTreg约占正常人或小鼠外周CD4+T细胞的5%～10%[12]。 但nTreg发育并获取抑制能力所需的信号依然还不清楚，在TCR转基因小鼠的研究中，人们发现，胸腺中的Treg发育需要高亲和力TCR刺激并依赖于B7分子的共刺激信号[13]。nTreg构成独特的胸腺来源的T细胞谱系，其具有抑制抗原呈递细胞（APC）活化和功能的能力，如树突细胞（DC）、单核细胞和B细胞以及效应T细胞[14]。在外周循环中nTreg主要表达CD25、Foxp3、CCR4、PD-1 和低水平的 CD127，并且它们通过分泌IL-10、IL-35、TGF-β发挥负向调控作用。其中Foxp3被认为是小鼠和人类中Treg的最特异性标记物[15]。

2.2 iTreg iTreg细胞在生理应激或疾病状况下可在胸腺外发育，并在胸腺外通过炎症和疾病过程的诱导获得CD25的表达，如自身免疫性疾病或癌症。 iTreg细胞频率和功能特性很重要，因为iTreg数量的增加可能有利于慢性感染的建立[16]。iTreg和nTreg具有相似的功能，nTreg细胞与iTreg细胞在维持耐受性方面的贡献尚不清楚，但两者都很重要。在nTreg和iTreg细胞之间观察到表观遗传差异，前者具有更稳定的Foxp3表达和更广泛的去甲基化。有研究显示，CD39+iTreg细胞与CD39-iTreg细胞相比显示出增强的增殖和抑制能力以及更低的炎性细胞因子表达[17]。Notch和TGF-β信号通路在iTreg分化中发挥着重要作用。已经观察到，在HBV相关的肝损伤的不同阶段，Notch信号传导参与调节外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）和肝脏中 FoxP3+Treg。阻断肝脏浸润的淋巴细胞中的Notch信号传导会显著降低FoxP3的表达，强烈表明Notch信号影响FoxP3表达[18]。

在急性HBV感染时，Notch信号传导上调，促进CD8+T细胞增殖活化产生IFN-γ。然而，在慢性HBV感染时，Notch信号分子的表达降低，但随着乙型肝炎肝硬化和HCC的发展，Notch表达再次增加。在HBV感染的肝硬化患者Notch可诱导肝内淋巴细胞表达FoxP318。除Notch外，TGF-β信号传导也有助于区分肝硬化和HCC患者iTregs与普通T细胞。同时，Notch信号传导增强TGF-β功能[19]。

3 Treg免疫抑制机制

Treg发挥免疫抑制的机制目前依然不是很清楚，但有越来越多的证据表明Treg可通过多种机制发挥免疫调节功能，如分泌抑炎细胞因子IL-10和TGF-β[20]。此外，Treg表达糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白 4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4）等免疫共抑制分子，并可通过细胞接触来发挥其抑制作用[21]。除上述机制外，IL-2受体CD25在Treg上的高表达导致Treg与效应T细胞竞争性结合IL-2，从而使效应T细胞处于“饥饿”状态，抑制其增殖并最终导致效应T细胞凋亡。给予外源IL-2则可以消除Treg介导的增殖抑制作用[22]。然而，有研究表明，Treg抑制T细胞功能，IL-2的消耗并不是抑制增殖的原因，因为通过阻断CD25并未在Treg的最佳刺激条件下消除抑制。值得注意的是，在次优刺激条件下，人类Treg需要CD25信号才能获得抑制能力，Treg的IL-2消耗和对靶细胞的抑制可能仅在某些情况下起作用[23]。

IL-35是新近发现与Treg细胞介导的免疫抑制作用有关的细胞因子，可以直接抑制T细胞增殖[24]。IL-35表达缺陷的Treg在体外和体内的抑制能力均明显降低。与小鼠Treg相反，人类Treg并不表达IL-35。尽管如此，IL-35依然可能在人体免疫抑制中发挥重要作用，因为用IL-35处理人或小鼠初始T细胞均诱导产生了所谓的iTR35调节群，该群体通过IL-35的介导发挥抑制作用，并且不需要IL-10或TGF-β的参与[25]。虽然人类幼稚Treg没有大量表达IL-35，但长期刺激Treg可以导致IL-35表达上调。这些活化的Treg以IL-35依赖性方式发挥与非接触依赖性的体外抑制作用，并且还诱导iTR35细胞的产生[26]。

4 Treg与HBV

HBV感染可以诱导Treg数量及在肝内浸润增加。来自HBV感染小鼠模型的研究工作显示，急性HBV感染过程中肝内Treg细胞数量显著增多，但其增殖水平并未增加，提示Treg为趋化募集进入肝脏。进一步的表型分析显示在此过程中Treg的表型并未出现明显改变，但其仍然保留了抑制HBV特异性效应T细胞应答的能力[27，28]。敲除Treg可以导致肝内HBV特异性T细胞增强且病毒清除加速，但同时也会加重肝脏损伤，提示Treg在急性HBV感染过程中发挥调控效应T细胞应答强度和避免免疫损伤的生物学效应。在慢性HBV感染过程中，Treg的数量亦显著增多。相比于健康人和自限性恢复的个体，在慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞和肝内中有着更高频率的CD4+CD25+Treg细胞，并与血清病毒载量呈正相关[29]。将Treg去除后，患者外周血单个核细胞针对HBsAg刺激产生IFN-γ的水平显著增加。

慢性乙型肝炎患者体内Treg的数量也与是否接受抗病毒治疗有关。有研究表明，核苷类似物治疗可以显著降低外周循环中Treg的比例，且这种降低伴随着HBV特异性T细胞应答的增强，同时HBV DNA下降[30，31]。除核苷类似物外，聚乙二醇干扰素（peg-IFNα）治疗同样可以显著减少慢性乙型肝炎患者外周循环中Treg细胞的数量。另外，Treg和Th17应答平衡是机体免疫功能变化的重要指标。研究显示，与健康对照组相比，慢性乙型肝炎患者体内Th17细胞数量亦显著增加，且IL-17水平也明显增高，这部分CHB患者在经过Peg-IFNα治疗后，Treg细胞、Th17细胞以及IL-17水平均明显下降[32]。Treg/Th17比值还可用于预测核苷酸类似物治疗CHB患者的应答状况。研究显示在替比夫定的治疗过程中，Treg/Th17比值基线值越低，经治疗后获得HBeAg转阴的几率越大[33]。

Treg通过分泌IL-10和IL-35等抑炎细胞因子发挥免疫抑制效应。在乙型肝炎感染过程中可见IL-10表达水平升高，且IL-10水平与血清病毒滴度及肝脏炎症程度密切相关[34]。在慢性HBV感染患者外周CD4+T细胞中可检测到IL-35，而在健康个体中却无法检测到[35]。这些细胞因子可能通过抑制T细胞的增殖和效应功能，从而参与乙型肝炎免疫耐受的维持。新近研究还显示，Treg可通过其表达的CTLA-4抑制滤泡辅助性T细胞（Tfh）的功能，从而导致其无法辅助B细胞功能成熟产生中和性抗体，导致HBV感染持续。若通过抗体阻断CTLA-4的功能，则可恢复Tfh和B细胞的活化，介导病毒的清除[36]。

5 总结

抗病毒免疫应答的发生和强度受到免疫系统复杂调控网络的严密调控。在慢性HBV感染过程中，病毒利用机体的免疫负调机制如免疫检查点分子和Treg等来抑制抗病毒特异性免疫应答，诱导针对病毒的免疫耐受。设计针对这些免疫负向调控因子的靶向治疗手段，有望重建CHB患者体内的HBV特异性抗病毒免疫应答，从而使患者能够依靠自身免疫系统而非核苷类似物等抗病毒药物实现对HBV感染的持续性免疫控制，达到功能性甚至是彻底治愈的状态。同时，我们必须看到Treg等免疫负调因素在维持机体免疫自稳状态中的重要作用，设计相应免疫治疗策略时需慎重和权衡利弊。因此，仍需进一步深入阐明HBV感染过程中Treg发挥的生物学作用及其相关的细胞和分子机制。