N6-甲基腺嘌呤与癌症的研究进展

张玫茵 综述 娄 阁 审校

表观遗传学是研究不涉及核DNA序列变化的可逆和可遗传的表型变化。这些动态变化影响着基因表达和蛋白质功能等关键的生物学过程。组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化也在调节基因表达和维持染色体结构中发挥重要作用[1]。与表观遗传DNA修饰类似，研究人员已发现一百余种类型的RNA修饰[2]，其中，RNA甲基化是RNA修饰的主要形式，这些修饰包括N6-甲基腺嘌呤(m6A)、N7-甲基鸟嘌呤(m7G)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、N1-甲基腺嘌呤(m1A)，其中m6A是一种最常见、含量最丰富的RNA分子内部修饰物，它在干细胞的自我更新和分化、mRNA转录、选择性剪接、核输出、翻译、降解和microRNA的加工中发挥重要作用，而且在一定程度上决定了特定基因的表达或失活，对生长和发育有着重大影响。因此，目前人们对它的研究十分广泛。

1 m6A甲基化的基本概念

腺嘌呤第六个原子上的N6-甲基腺嘌呤甲基化，也称为m6A RNA修饰，是高度保守的，广泛存在于大多数真核生物物种(从酵母、植物到哺乳动物)以及病毒mRNA中，并在转录后的mRNA加工和代谢过程中发挥关键的调控作用。m6A可动态改变mRNA的二级结构，调节mRNA-蛋白质相互作用，影响mRNA的选择性剪接。Chen等[3]人发现microRNA通过序列匹配机制调节METTL3与mRNA的结合并影响m6A的形成。他们的研究还表明，METTL3的过度表达显著增加了m6A的水平，进一步增加了小鼠成纤维细胞重编程为多能干细胞的效率。Alarcon等[4]发现HNRN-PA2B1可以识别并结合pre-microRNA转录本上的m6A并参与microRNA的剪接过程。另外，Xiao等[5]已发现THDC1与SRSF3相互作用以控制mRNA剪接。总之，m6A是一种新型的表观遗传RNA修饰，它调节基因表达，在许多生命过程中至关重要。

2 m6A与癌症的关系

2.1 m6A甲基转移酶复合物与癌症

m6A甲基转移酶复合物利用S-ad-烯醇甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，甲基化腺嘌呤第6位N中心的氢。METTL3有两个SAM结合位点，催化m6A合成。免疫荧光分析显示，METTL3主要分布在RNA加工的主要部位-核散斑中，说明m6A在RNA加工中起着重要的调控作用。METTL3在人体组织中含量很高，特别是在睾丸中，并且在多种组织中是保守的。敲减METTL3导致HeLa细胞和HepG2细胞凋亡和m6A水平降低[6]。Liu等[7]报道，METTL14也具有SAM结合位点，可催化m6A合成。因此，MELLT14被认为是m6A甲基转移酶复合物的另一个亚基。在m6A合成过程中，METTL14和METTL3以1∶1的比例形成稳定的异二聚体，这个异二聚体的特点是酶活性高，底物偏好性强。

METLL3通过与细胞质中的翻译起始复合物eIF3b相互作用，促进含有大量m6A的致癌基因的mRNA的翻译。增加METTL3的表达可促进肺癌细胞的增殖、生长和侵袭[8]。2017年，Du等[9]报道METTL3在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达高于癌旁组织。METTL3在NSCLC组织中的表达与miR-33a的表达呈正相关。miR-33a能够在mRNA和蛋白水平上降低METTL3的表达，揭示了miRNA调控METTL3的新机制。Cui等[10]发现，敲低METTL3或METTL14可明显增强干细胞的生长和胶质母细胞瘤细胞的自我更新能力，从而促进肿瘤的发展，而过表达METTL3则有相反效果。m6A在白血病中可能发挥的作用也得到了明确的证实。Vu和他的团队在急性髓性白血病(AML)患者中发现，METTL3在AML细胞和原代白血病细胞中高表达。shRNA敲低METTL3后，AML细胞中m6A水平降低，分化和凋亡显著增加，克隆形成能力下降。m6A个体核苷酸分辨率交联、免疫沉淀(miCLIP)和RNA-seq分析显示，METTL3提高了靶基因C-MYC和BCL2中mRNA的m6A水平，并通过稳定mRNA来增强其翻译，从而导致靶基因的更高表达，同时使AML细胞保持未分化状态[11]。Weng等[12]发现METTL14的mRNA在正常造血干祖细胞(HSPCs)和包括t(11q23)、t(15；17)和t(8；21)的AML白血病细胞中富集，细胞分化后下调。敲低METTL14可促进正常HSPCs和AML细胞的分化，但抑制后者的增殖。进一步研究表明，METTL14通过抑制靶基因的表达，维持白血病干细胞起始细胞(LSCS LICs)及其自我更新，并通过调节MYB、MYC等靶基因mRNA中m6A的水平促进白血病的发生。

最近的研究表明[13]，在宫颈癌细胞系SiHa中，通过使用shRNA敲低METTL3/METTL14或过度表达FTO ALKBH5后，m6A水平的降低促进了肿瘤生长。相反，m6A水平升高抑制宫颈癌细胞的生长，因此提示METTL3和METTL14在宫颈癌中的抑癌作用。对肾细胞癌的调查发现，METTL3在肾细胞癌患者中的高表达提示预后良好，这意味着METTL3可能在肾细胞癌的细胞增殖、侵袭和转移过程中起着肿瘤抑制基因的作用。METTL3可能通过调节上皮间质转化和PI3K-Akt-mTOR通路发挥作用[14]。总之，METTL3和METTL14在肺癌和急性髓性白血病中具有致癌作用，在胶质母细胞瘤、宫颈癌和肾癌中具有肿瘤抑制作用。

2.2 m6A去甲基化酶和癌症

研究人员发现脂肪团和肥胖相关蛋白(Fat mass and obesity-associated protein，FTO)是m6A mRNA去甲基化酶，而且，它的发现证明了m6A的修饰是动态的和可逆的。m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5能以α-酮戊二酸和铁依赖的方式催化m6A去甲基化[15]。最近，研究报道了FTO和ALKBH5在许多生物过程中发挥关键作用，包括生物发育、代谢和繁殖。已知FTO位于细胞核内，并与人体体重和体重指数的增加密切相关。另一种去甲基化酶ALKBH5在大多数组织中表达，特别是在睾丸中丰富。像FTO一样，ALKBH5在核散斑中含量丰富，其损失明显影响核散斑中的RNA代谢和mRNA组装。尽管小鼠ALKBH5缺失不影响生长和生理，但由于减数分裂中期精母细胞的凋亡，生育力受损[15]。据报道[16]，FTO在MLL重排、FLT3-ITD和/或NPM1突变的AML中高表达，与MLL重排的AML细胞中突变FTO(H231A和D233A)的过表达相比较，只有野生型FTO的过表达促进白血病细胞生长。敲除FTO后，m6A的水平上调，表明FTO通过调节m6A修饰来调节这种表型。这种表型也出现在PML-RARA和FLT-ITD NPM1突变的AML中。骨髓移植实验表明，FTO的过度表达可加速MLL-AF9诱导的白血病发生。该研究表明，FTO过表达后，由于AML细胞中低甲基化的m6A峰，含SOCS盒2(ASB2)和视黄酸受体-α(RAR α)的mRNA下调。这两种蛋白在全反式维甲酸(ATRA)诱导的差异白血病细胞中上调[17-18]。进一步的研究表明，FTO通过调控ASB2和RARA的转录来阻断逆转的AML细胞分化，从而表明FTO在白血病发生中的关键致癌作用。

胶质母细胞瘤(GSCs)的不良预后与ALKBH5过表达相关[20]。ALKBH5的沉默抑制了GSCs的增殖。将m6A IP-seq和GSC的转录组分析与ALKBH5的敲除整合，筛选出了forkhead box M1(FOXM1)基因，其是ALKBH5的重要靶基因。高表达的FOXM1是细胞周期的关键蛋白，这与恶性神经胶质瘤预后不良有关。降低m6A水平增强了人抗原R(HUR)与FOXM1的前体mRNA之间的连接，从增加了FOXM1前体mRNA的稳定性，同时进一步证实了FOXM1在GSC肿瘤发生中起到关键作用[20]。在乳腺癌干细胞(BCSCs)中，缺氧导致ALKBH5高表达，并以HIF-依赖性方式降低m6A水平[21]。这种去甲基化增强了NANOG mRNA的稳定性并导致NANOG上调。虽然ALKBH5的缺乏削弱了由缺氧诱导的BCSC富集，但ALKBH5的过度表达也表明了缺氧。因此，HIF-依赖的ALKBH5的表达有助于BCSC在低氧肿瘤微环境中的富集。此外，乳腺癌患者的METTL14水平明显降低，并且与较短的生存时间密切相关[16]。

2.3 m6A结合蛋白与癌症

YTHDF2作为m6A的阅读器，通过识别和结合靶RNA的m6A位点影响RNA的稳定性。目前，已发现三种蛋白质YTH-DF1/2/3是m6A的结合蛋白。三者都含有一个相对保守的羧基末端YTH结构域与m6A结合。YTHDF2选择性结合m6A修饰的mRNA，将其募集到mRNA降解位点，控制其稳定性，并通过CCR4-NOT介导的去甲基化促进mRNA降解[21]。YTHDF1与翻译起始因子相互作用以增强靶RNA翻译[9]。YTHDF3和YTHDF1之间的协同作用促进翻译和YTHDF2诱导的mRNA降解[22-23]。因此，这三种蛋白质YTHDF1/2/3共同调节RNA的代谢。YTH(YT521-B homology)结构域蛋白1(YTH domain containing 1，YTHDC1)是一种调节剪接的核m6A结合蛋白[24-25]。不同的核蛋白A2/B1(HNRNPA2B1)结合m6A修饰的转录因子并调节microRNA(miRNA)在细胞核中的剪接和成熟。此外，m6A还可以抑制RNA的二级结构，调节m6A邻近区域的RNA结合蛋白的RNA结合能力。这种机制被称为m6A开关，促进HNRNPC和HNRNPG与靶基因的结合，控制mRNA的丰度和剪接[25-29]。

在妇科肿瘤细胞系中，由于缺氧，YTHDC1蛋白水平的降低改变了RNA剪接。结果表明，m6A结合蛋白YTHDF2增强了HIF-1的翻译并导致结肠肿瘤的转移[30-31]。研究表明，癌基因c-Myc促进m6A结合蛋白YTHDF1在结直肠癌中的表达，而它的敲除抑制YTHDF1的表达[32]，由此表明，m6A结合蛋白YTHDF1在结直肠癌的进展中发挥重要作用。

3 小结与展望

最近研究表明，被m6A修饰的蛋白在多种癌症中发挥重要的作用。一些m6A相关蛋白可能对不同类型的癌症产生相似的影响，而另一些蛋白质可能在相似类型的癌症中发挥不同的作用。例如，FTO已被证明在白血病和GBM中有致癌作用，相反，ALKBH5在GBM和乳腺癌中起致癌作用，在白血病中起抑癌作用。同样，METTL3在肺癌中具有肿瘤促进作用，在GBM中具有肿瘤抑制作用。通过调节不同的靶基因，m6A修饰的甲基转移酶和去甲基化酶可能在不同类型的癌症中发挥相似功能。这些m6A修饰的调控因子可以是癌症诊断和药物研发的新靶点。目前，FTO和ALKBH5的致癌作用已被证实，它们的抑制剂可作为抗癌药物开发的候选药物。这些抑制剂通过调节癌细胞中的m6A修饰水平来抑制其生长。尽管这些抑制剂尚未在体内和临床试验中得到验证，但它提供了开发m6A特异性调节剂的线索，并为抗癌药物开发提供了新的药理学靶点。因此，我们更要进一步研究由m6A介导的基因在不同类型癌症中的生物学功能和相关分子机制，为癌症的早期诊断和治疗提供更多的可能。