高效液相色谱-串联质谱法测定香连丸中主要成分的含量△

卢敏，熊山，牟艳玲*

1.济南大学/山东省医学科学院 医学与生命科学学院，山东 济南 250200； 2.山东省医学科学院 药物研究所/山东第一医科大学，山东 济南 250062；3.国家卫生部生物技术药物重点实验室，山东 济南 250062；4.山东省罕少见病重点实验室，山东 济南 250062

香连丸是治下痢的古代名方，临床上现多应用于消化系统疾病的治疗。通过文献的初步考证，香连丸始于唐代李绛《兵部手集方》，至宋代《太平惠民和剂局方》名为“大香连丸”。据现行《中华人民共和国药典》及部颁药品《标准》所载的中成药香连丸为黄连和木香以相使配伍的关系组成，处方均为黄连(吴茱萸制)与木香4∶1，醋糊为丸[1-2]。方中黄连清热燥湿、泻火解毒、疏肝和胃止呕，木香主治行气止痛、健脾消食，二者组成香连丸，具有清热化湿、行气止痛之功效，主要用于痢疾、泄泻、肠炎与胃炎等疾病[3]。

香连丸的主要成分为萸黄连、木香。黄连中有黄连碱、巴马汀、药根碱、盐酸小檗碱等有效成分[4]，木香中有木香烃内酯和去氢木香内酯等有效成分[5]。《中华人民共和国药典》2015年版有对于香连丸中盐酸小檗碱的高效液相色谱(HPLC)法定量测定方法，仅以盐酸小檗碱作为质量控制指标，难以全面控制其质量，有必要制定较为全面的香连丸多指标质量评价标准[6-7]。为了保证香连丸的用药质量，本实验对香连丸中小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、木香烃内酯、去氢木香内酯的含量同时进行HPLC-MS/MS测定研究，为该复方香连丸多成分的质量控制提供了一种简单可行的定量方法，为提高检测速度及更好地控制生产过程质量提供了参考。

1 材料

1.1 仪器

ULTIMATE3000液相色谱-TSQ QUANTUM ULTRA质谱联用仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；SQP电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；D3024R台式高速(冷冻型)微量离心机(北京大龙兴创实验仪器有限公司)；IKA©Vortex天才3旋涡混匀器(广州艾卡仪器设备有限公司)；KQ3200DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

药根碱对照品(批号：S0913AS)、小檗碱对照品(批号：F0126AS)、巴马汀对照品(批号：B0613AS)、黄连碱对照品(批号：B0617AS)、木香烃内酯对照品(批号：N1106AS)、去氢木香内酯对照品(批号：A0708AS)均购自大连美仑生物有限公司，纯度均大于98.0%；奥美拉唑对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100367-201305)；香连丸(兰州佛慈制药股份有限公司，批号：16C2)；乙腈、甲醇(色谱纯，美国赛默飞世尔公司)；甲酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 实验方法

2.1.1 液相色谱条件 色谱柱采用Hypersil GOLD C18(50 mm × 2.1 mm，3 μm，Thermo)；流动相：A为0.1%的甲酸水，B为乙腈；梯度洗脱：0～0.2 min，A∶B(75∶25)；0.2～1.0 min，A∶B(75∶25～70∶30)；1.0～3.9 min，A∶B(70∶30～10∶90)；3.9～5.0 min，A∶B(10∶90)；5.0～6.0 min，A∶B(10∶90～75∶25)；流速0.5 mL min-1；进样量 2 μL；柱温：25 ℃。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，选择反应监测(SRM)；雾化温度：250 ℃；喷雾电压：3500 V；鞘气压力：35 Arb；辅助气压力：10 Arb；毛细管温度：350 ℃；选择离子采集模式，各被测物的部分质谱分析参数见表1。

表1 对照品的SRM条件

2.2 溶液的制备

2.2.1 内标溶液的配制 精密称取奥美拉唑对照品适量，加甲醇溶液制成质量浓度为2 mg mL-1的溶液，精密吸取该溶液适量，加甲醇稀释至500 ng mL-1，作为内标溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制 取本品适量，研细，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上述上清液适量，用甲醇稀释160倍，14 000 r min-1离心10 min，取上清液，即得。进样前，精密吸取各供试品溶液300 μL，内标溶液50 μL，混匀，进样分析。

2.2.3 混合对照品溶液的配制 精密称取小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、木香烃内酯、去氢木香内酯对照品适量，加甲醇溶液制成小檗碱1 μg mL-1，药根碱、黄连碱、巴马汀、木香烃内酯和去氢木香内酯为0.5 μg mL-1的混合对照品溶液，即得。进样前，精密吸取混合对照品溶液300 μL，内标溶液50 μL，混匀，进样分析。

2.3 专属性试验

分别取混合对照品溶液和供试品溶液按2.1.1和2.1.2项下的色谱质谱条件，进样2 μL，另取不含药材的辅料作为空白溶液，同法进样。特征图谱见图1，小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、木香烃内酯、去氢木香内酯的测定不受杂质干扰，峰形良好，结果表明，在拟定的色谱和质谱条件下，处方中的其他成分对测定结果无影响。

2.4 线性关系

分别吸取混合对照品溶液80、100、250、500、800、1000 μL，加甲醇定容至1.0 mL，分别吸取以上各混合对照品溶液300 μL，加入50 μL内标溶液，混匀，按2.1.1和2.1.2项下的色谱质谱条件进样2 μL测定，以被测组分与内标的峰面积的比值为纵坐标，相应的质量浓度为横坐标进行线性回归，测定进样质量浓度与相应质谱峰面积的关系，求得它们的回归方程、相关系数及线性范围。小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、木香烃内酯、去氢木香内酯的线性方程、相关系数和线性范围见表2。结果表明这6种化学成分在各自线性范围内呈良好的线性关系，仪器灵敏度较高。

2.5 精密度试验

取同一混合对照品溶液2 μL按2.1.1和2.1.2项下的色谱和质谱条件重复测定6次，计算小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、木香烃内酯、去氢木香内酯的峰面积RSD分别为1.47%、1.49%、1.62%、1.82%、1.67%、1.30%，n=6，说明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一样品(批号：16C2)6份，每份约0.1 g，精密称定，按2.2.2项下供试品溶液的配制方法处理，按2.1.1和2.1.2项下的色谱和质谱条件进行测定，测得香连丸中小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、木香烃内酯、去氢木香内酯平均质量分数分别为79.54、16.51、14.93、20.25、5.63、5.60 mg g-1，RSD分别为 0.45%、1.51%、1.02%、0.78%、0.88%、1.53%，n=6，表明重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液(批号：16C2)6份，分别于0、24 h按2.1.1和2.1.2项下的色谱和质谱条件进行测定。采用T检验进行分析，测得小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、木香烃内酯、去氢木香内酯的含量在0、24 h差异无统计学意义(P>0.05)，结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的样品(批号：16C2)9份，每份约0.05 g，精密称定，按样品含有量的80%、100%、120%添加对照品溶液后按2.2.2项下方法制备供试品溶液，每种比例各配制3份，离心后分别按2.1.1和2.1.2项下色谱和质谱条件进样测定，回收率结果见表3，结果表明该方法回收率良好。

注：A.空白溶液；B.对照品溶液；C.实际样品；Ⅰ.去氢木香内酯；Ⅱ.木香烃内酯；Ⅲ.黄连碱；Ⅳ.小檗碱；Ⅴ.药根碱；Ⅵ.巴马汀。图1 6种主要化学成分的SRM图

表2 6种主要化学成分的标准曲线测定结果

表3 加样回收率检测结果(n=9)

2.9 样品含量测定

取本品适量，约0.1 g，精密称定，按2.2.2项下供试品溶液的配制方法处理，按2.1.1和2.1.2项下的色谱和质谱条件进行测定，测得香连丸中小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、木香烃内酯、去氢木香内酯质量分数分别为80.99、18.21、16.98、22.79、4.47、5.12 mg g-1。

3 结论

近年来，随着现代分析技术的发展，液质联用技术成为天然药物复杂体系中活性成分快速分离和鉴定的有力手段。查阅相关文献[8-11]发现，目前香连丸中主要成分的含量测定使用的是HPLC，但存在分析方法时间较长、灵敏度较低等问题，HPLC-MS/MS与传统的HPLC相比分析速度更快，分离度更好，灵敏度更高，缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量、降低了分析成本[12]，通过方法学验证，该方法操作简便、准确、快捷，选择性好，结果准确，为有效控制香连丸质量提供了方法，为多成分全面评价香连丸质量提供一种思路。

本实验建立了同时测定香连丸中主要成分的含量测定方法，通过对色谱条件进行考察，包括乙腈和甲酸水的不同配比和梯度洗脱，柱温和进样量的选择，最终确定本实验色谱条件，能够有效地将6种化学成分分离，质谱信号用来定性和定量，质谱SRM技术通过两级离子选择，排除大量干扰离子，目标检测物的信噪比显著提高，从而实现了高灵敏度的检测。结果表明，本实验建立的方法简便、精密度好、灵敏度高、专属性强，能够有效测定香连丸中主要化学成分的含量。