白藜芦醇对卵巢癌增殖、迁移和侵袭的影响及可能机制

李 可，康 玉，陈 行*

（复旦大学附属妇产科医院妇科，上海 200011）

目前，卵巢癌的主要治疗方式为手术联合铂类、紫杉醇等一线化疗，虽然患者获得比较满意的近期疗效，但5年生存率仍然徘徊在30%～40%[1]。白藜芦醇是一类广泛存在与植物中的多酚类物质，具有抗炎、抗氧化甚至抗肿瘤的活性[2-3]。近年来，白藜芦醇的抗肿瘤作用在多个癌种中被验证，但是白藜芦醇对卵巢癌的抑制及其机制还不清楚。本研究拟采用多种人上皮性卵巢癌细胞系，研究白藜芦醇对卵巢癌的抑制作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

人上皮性卵巢癌:SKOV3,OVCAR3,OVCAR5,OVCA R8,CAOV3,ES2细胞由上海市肿瘤所惠赠。白藜芦醇购自Sigma-Aldrich公司(R5010纯度≥98%)；CCK8（Cell Counting Kit-8）试剂购自日本同仁公司（CK-04）。培养基RPMI-1640、DMSO、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；BCA蛋白试剂定量盒(美国Pierce公司)；β-ACTIN和GAPDH多克隆抗体美国Cell signaling Technology公司；Nrf2抗体购自英国Abcam公司（ab137550）；CO2培养箱和多功能酶标仪均购自美国Thermo Scientific公司;倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 实验方法

将购买的人卵巢癌细胞解冻复苏后，制成细胞悬浮液，接种于相应的培养基中(10%胎牛血清，100 U／ml青霉素，100 mg／ml链霉素)，常规培养于37℃，5%二氧化碳细胞培养箱，予以换液1～2天/次，显微镜下观察，待细胞长至对数生长期时用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化后传代。

1.3 数据统计

所有实验重复至少三次。采用SPSS 20.0对数据进行统计分析。采用one-way ANOVA对多组间样本均数进行比较，组间两两比较采用LSD-t检验。采用GraphPad Prism 6.0软件进行作图分析。计量资料记录方式为均数±标准差(Mean±SD)，P＜0.05为有统计学意义(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。

2 结 果

2.1 不同浓度白藜芦醇对卵巢癌细胞增殖情况的影响

选择四种卵巢癌细胞系，将对照组（仅培养液）的细胞活性设置为100%，与对照组相比，白藜芦醇（不同浓度梯度）处理后，卵巢癌细胞的活性逐渐降低，且呈药物浓度依赖性，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 白藜芦醇处理不同卵巢癌细胞后细胞的凋亡情况

采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡技术，与对照组（仅DMSO）相比，白藜芦醇处理组凋亡显著，且呈时间依赖性，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 白藜芦醇处理卵巢癌细胞后Nrf2基因水平的表达

利用PCR检测白藜芦醇处理卵巢癌细胞系后Nrf2在mRNA水平上的表达，结果显示，与对照组相比（仅培养液），加入白藜芦醇后Nrf2表达升高。

2.4 白藜芦醇处理卵巢癌细胞后Nrf2蛋白水平的表达

Western blot检测结果表明，与对照组比较，使用白藜芦醇处理卵巢癌细胞系24和48小时后，Nrf2蛋白表达增强。经统计分析发现，与对照组Nrf2蛋白表达相比，白藜芦醇处理卵巢癌细胞24和48小时后的Nrf2蛋白表达增强均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

卵巢癌因其发病隐匿、诊断多为晚期且较易耐药复发，是死亡率位居首位的妇科恶性肿瘤。其不断增殖和失巢凋亡的特性，其致死率居高不下，因此，探究抑制卵巢癌的增殖和失巢凋亡的药物，是抑制卵巢癌进展，提高生存率的关键。目前，大量研究表明白藜芦醇可诱导多种肿瘤细胞凋亡、抑制多种肿瘤细胞增殖的作用。

白藜芦醇是1940年首次发现的植物提取化合物，因其具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种生物活性，近几年引起众多研究人员的重视。Jang等首次提出白藜芦醇具有抗癌活性，其能够通过多条途径调节癌细胞的增殖、凋亡、迁移和血管生成，且具有极低的毒性及副作用。本研究表明，白藜芦醇组多种卵巢癌细胞的增殖能力显著低于对照组，且细胞凋亡率显著高于对照组，且差异均有统计学差异，提示白藜芦醇能够抑制卵巢癌细胞的增殖能力，并能够诱导卵巢癌细胞凋亡。

为进一步探索白藜芦醇抑制卵巢癌增殖和诱导凋亡的作用机制，我们通过检索大量文献发现，白藜芦醇具有激活核转录相关因子2(Nrf2)的作用，而Nrf2的激活障碍与癌症进展有着密切相关性。本研究表明，白藜芦醇组Nrf2表达水平无论是在mRNA水平水平还是蛋白水平，均表达增加，提示白藜芦醇能够通过上调Nrf2表达水平抑制卵巢癌细胞的增殖，诱导卵巢癌细胞凋亡。

综上所述，目前尽管国内外学者在白藜芦醇抗女性生殖系统恶性肿瘤方面的研究已经取得一定的进展，但针对其具体作用机制的研究还不是十分深入。由于白藜芦醇可以对多种女性生殖系统恶性肿瘤起到抑制生长促进凋亡的作用，再加上其无毒副作用的优势，因此有望成为新一代的抗肿瘤药物。