天津地区日本沼虾群体遗传多样性的微卫星分析
2019-02-07王永辰姜巨峰刘肖莲宋立民吴会民李楠马林高哲颖
王永辰 姜巨峰 刘肖莲 宋立民 吴会民 李楠 马林 高哲颖
摘 要：为了评估天津地区日本沼虾（Macrobrachium nipponense）野生种质资源遗传背景，采用9对微卫星分子标记（Mn33、Mn37、Mni04、Mni01、Mni06、Mni76、Mni13、Mni40、Mni58）对日本沼虾4个野生群体（YDXH、DLJH、XQLH和YQSK）进行了遗传多样性研究。结果表明，9对微卫星引物在日本沼虾4个群体中的等位基因数（Na）为3～12，有效等位基因数（Ne）为1.976 9～10.816 5，观测杂合度（Ho）为0.285 7～0.975 0，期望杂合度（He）为0.494 2～0.896 7，多态信息含量（PIC）为0.474 9～0.888 0，说明日本沼虾群体的遗传多样性水平较高;分子方差分析（AMOVA）显示，群体中仅有2.04%（P<0.01）的遗传变异来源于群体间，97.96%（P<0.01）的变异来源于群体内，表明遗传差变异主要存在于个体间;群体间遗传分化指数（Fst）为0.010 4～0.037 7，说明群体间的遗传分化程度并不明显;基于群体间Neis遗传距离采用UPGMA法对4个群体进行聚类树构建，永定新河（YDXH）与独流减河（DLJH）首先聚为一支，其次与西七里海（XQLH）聚为一支，最后与于桥水库（YQSK）聚为一支。
关键词：天津地区;日本沼虾;微卫星;遗传多样性
中图分类号：S966.12; Q347 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.12.009
Abstract： In order to investigate the genetic background of wild Macrobrachium nipponense resources in Tianjin， nine microsatellite markers （Mn33， Mn37， Mni04， Mni01， Mni06， Mni76， Mni13， Mni40， Mni58） were used to analyze the genetic diversity of four populations of M. nipponense （YDXH， DLJH， XQLH and YQSK）. The results demonstrated that number of alleles （Na） was 3～12， number of effective allele （Ne） was 1.976 9～10.816 5， observed heterozygosity （Ho） was 0.285 7～0.975 0， expected heterozygosity （He） was 0.494 2～0.896 7 and polymorphic information content（PIC） was 0.474 9～0.888 0， indicating that the four populations had a high genetic diversity. AMOVA analysis revealed that 2.04% of the total genetic variation was among populations and 97.96% was among individuals. Genetic differentiation index（Fst） （0.010 4～0.037 7） suggested that there was low genetic differentiation among these populations. The UPGMA phylogenetic tree revealed that YDXH and DLJH clustered into one group， then to XQLH， finally to YQSK.
Key words： Tianjin; Macrobrachium nipponense; microsatellite; genetic diversity
日本沼虾（Macrobrachium nipponense），俗名河虾、青虾，隶属甲壳纲（Crustarcea）十足目（Decaplda）长臂虾科（Palaemonidae）沼虾属（Macrobrachium），于我国各地淡水水域中均有分布[1]，据统计，2016年全国日本沼虾养殖总产量已达到27.26万t[2]，是产量较高的淡水养殖经济虾类之一[3]。近年来，日本沼虾养殖业快速发展的同时，也面临着性早熟、生长慢、抗病力下降等一系列问题。另外，由于无序开发导致天然生境改变等因素使野生优异种质也遭到一定程度的破坏，资源量下降，限制了日本沼虾的可持续发展。因此，日本沼虾的种质资源研究逐渐被重视并广泛开展[4-10]。
通过对群体遗传多样性和遗传结构的研究，可以了解种群种质资源现状，评估其育种潜力，这是选育良种的前期基础工作[6]。分子生物学的快速发展，促进了分子遗传标记技术的进步，其作为一种检测生物遗传多样性的方法被广泛应用，在种群遗传结构分析、种质鉴定、亲缘关系分析及遗传连锁图谱构建等方面发挥着十分重要的作用[11-12]。微卫星（SSR）是一种应用比较广泛的分子遗传标记，已应用于太湖、洪泽湖、钱塘江、洞庭湖、鄱阳湖、龙感湖、白洋淀、衡水湖、微山湖、洪泽湖、女山湖、巢湖、姑溪河、南漪湖、长江东至段、升金湖等湖、河、江段日本沼虾的遗传多样性研究[5，9，13-16]。天津地处华北平原东北部、海河流域下游，历史上水量丰沛，流经天津的海河干流及南运河、北运河、子牙河、永定河、潮白河、蓟运河等河流，构成了丰富的水系，被誉为“九河下梢”，同样孕育着丰富的日本沼虾野生种质资源。目前仍未見专门针对天津地区日本沼虾遗传多样性研究的相关报道。
本研究利用SSR标记，分析了天津地区永定新河、独流减河、西七里海和于桥水库4个日本沼虾野生群体的遗传多样性，探讨其遗传结构和群体间遗传关系，以期为天津地区野生日本沼虾种质资源的保护和合理开发利用以及品种改良提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
采集天津地区日本沼虾野生群体4个，分别为永定新河群体（YDXH）、独流减河群体（DLJH）、西七里海群体（XQLH）和于桥水库群体（YQSK），具体位置详见图1，每个群体的样本数分别为40，40，38和40尾。剪取尾部肌肉用无水乙醇固定后，于4 ℃冰箱保存备用。
1.2 基因组提取
采用天根生化科技（北京）有限公司的组织基因组提取试剂盒（DP304）提取基因组DNA，用核酸蛋白仪（Nanodrop 基因有限公司）测量DNA浓度，并根据测量结果将DNA稀释到100 μg·mL-1。
1.3 微卫星扩增
本试验所用引物来自于已公开发表的引物[7，14-15，17-18]，委托上海生工生物工程技术服务公司合成。引物的基本信息见表1。
PCR反应总体积10 μL，包括10×buffer 1.0 μL，2.5 mmol·L-1 dNTPs 0.8 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，5 U·μL-1 Taq酶0.1 μL，10 ng·μL-1基因组DNA 1.0 μL，用无菌水补足体积至10 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，退火温度30 s，72 ℃ 45 s， 共35个循环; 最后72 ℃延伸10 min。
1.4 毛细管电泳分析
PCR反应体系：1 μL PCR产物，0.1 μL GeneScan-500 LIZ Size Standard，9.9 μL HI-DI Formamide。反应体系于95 ℃条件下5 min，于冰上冷置5 min，利用ABI3730基因分析仪（Applied Biosystems）进行毛细管电泳。
1.5 数据统计及分析
根据产物片段大小读取各个位点的基因型，利用POPGene1.32软件计算出群体的等位基因数（Number of alleles，Na）、有效等位基因数（Effective number of alleles，Ne）、期望杂合度（（Expected heterozygosity，He）、观测杂合度（Observed heterozy-gosity，Ho）、群体近交指数（Within population inbreeding coefficient，Fis）以及群体间的Neis遗传距离（Genetic Distance）。根据等位基因频率分布，利用PIC-Calc软件计算出微卫星位点的多态信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）。利用Genepop进行哈迪-温伯格平衡检验，根据P值判断位点是否处于平衡状态。根据公式D=（Ho-He）/He计算遗传偏离指数。
利用软件ARLEQUIN 3.1计算出两两群体间的遗传分化指数（Population differentiation coefficient，Fst），并基于遗传距离用MEGA5软件构建UPGMA系统进化树。
2 结果与分析
2.1 位点多态性
部分位点的毛细管电泳峰图如图2、图3和图4所示，4个日本沼虾群体中的遗传多样性指数如表2所示，等位基因数Na介于10～22之间;有效等位基因数Ne介于2.422 7～10.130 6之间;期望杂合度He介于0.587 2～0.901 3之间;观测杂合度Ho介于0.448 3～0.926 7之间;多态信息含量PIC介于0.550 4～0.893 1之间，大于0.5，所有位点均具有较高的多态性。
2.2 日本沼虾群体遗传多样性分析
日本沼虾4个群体的遗传多样性指数见表3。4个群体中，平均等位基因数（Na）最大的是永定新河（9.888 9），最小的是于桥水库（8.777 8）。与观察得到的等位基因数相比较，每个位点的有效等位基因数（Ne）占平均等位基因数（Na）的比例偏低，表明每个等位基因在群体中的分布并不均匀，其中等位基因分布最不均匀的是位点Mni58，该位点在4个群体中的等位基因数（Na）介于9～13之间，有效等位基因数（Ne）介于2.363 6～3.243 1之间，从毛细管电泳峰（图4）可以看出，在Mni58中，等位基因290/298出现频率较高，其他等位基因出现频率较低。在所有群体中平均期望杂合度（He）最高的是独流减河群体（0.741 1），接下来的依次是西七里海群体（0.738 0）、于桥水库群体（0.730 8）、永定新河群体（0.634 2），除永定新河群体外，其他3个群体的平均观测杂合度值（Ho）均低于平均期望杂合度。对6个群体所有位点进行哈迪-温伯格平衡检验，发现在经过Bonferroni校正后，永定新河群体有4个位点，独流减河群体有4个位点，西七里海群体有3个位点，于桥水库有1个位点显著偏离哈迪-温伯格平衡（P<0.01）。近交系数（Fis）结果表明，各个位点在4个群体中的Fis介于-0.290～0.530之间，在4个群体中仅于桥水库群体各位点的近交系数均值（-0.009）小于0，表明该群体在进化过程中有外来基因的参与，而其他3个群体的近交系数均大于0，在群体演变过程中存在近交现象。
2.3 日本沼蝦群体遗传分化指数
对日本沼虾4个群体的Fst值分别进行分析，结果见表4。遗传分化指数Fst<0.05表明群体间存在较小的遗传差异;0.05 由表5可知，日本沼虾群体间Neis遗传距离介于0.054 7～0.097 7之间，遗传相似度介于0.906 9～0.946 7之间。其中，独流减河与永定新河群体间的遗传距离最近，遗传相似度最高，而于桥水库与独流减河的遗传距离最远，遗传相似度最低。根据遗传距离利用UPGMA对4个日本沼虾群体进行聚类分析，结果（图5）表明，永定新河与独流减河首先聚为一支，其次与西七里海聚为一支，最后与于桥水库聚为一支。 AMOVA分析结果（表6）表明，群体中仅有2.04%（P<0.01）的遗传变异来源于群体间，而97.96%（P<0.01）的变异来源于群体内，说明遗传差异主要存在于个体间，个体间的遗传变异远大于群体之间的遗传变异。 3 结论与讨论 地球上所有生命体携带的遗传信息的总和称之为遗传多样性，遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是物种在复杂多变的环境中维持生存并取得适应性进化的基础，一个物种的遗传变异越大通常其遗传进化潜力会越高。分子遗传标记技术已经被广泛用于生物遗传多样性的检测，其中微卫星分子标记（SSR）与其他分子遗传标记相比具有多态性丰富、共显性等优点，故在分析水产动物遗传多样性方面SSR法便成为了比较常用的分子标记[19]。 微卫星位点的多态性可以用多态信息含量（PIC）来衡量，PIC通常能够反映某群体的遗传变异程度、位点多样性等[19]。按照Botstein等[20]描述的划分标准，当某个群体的PIC>0.50时，则表明该位点为高度多态;当0.25 基因杂合度表示群体中某个位点上杂合子的频率，反映出群体的遗传变异程度，通常被认为是衡量群体遗传变异的最适参数[21]。本研究检测的日本沼虾永定新河、独流减河、西七里海和于桥水库群体的平均观测杂合度依次为0.732 9，0.693 8，0.661 4和0.747 0，平均期望杂合度依次为0.634 2，0.741 1，0.738 0和0.730 8，4个样本群体杂合度均较高，说明具有较好的选育潜力。 哈迪-温伯格平衡是指一个较大的、随机交配的种群，在没有迁移、选择、突变的前提下，群体中各基因频率和基因型频率是稳定不变的，即保持着基因平衡。在本试验中有部分微卫星位点出现了偏离哈迪-温伯格平衡的现象，这可能与群体生存环境变化或过度捕捞等人为影响，日本沼虾发生小种群同型交配，产生不同程度的遗传漂变有关。哈迪-温伯格遗传偏离指数D主要反映的是Ho与He之间的平衡关系，D值越接近于0，说明基因型的分布就越接近于平衡状态;D值越偏离0，基因型分布越偏离平衡状态;D大于0则说明杂合子过剩，D小于0说明杂合子缺失[19]。本研究中4个群体仅在少部分位点表现为杂合子过剩而大部分位点表现为杂合子缺失，杂合子缺失产生的原因除了遗传漂变之外，也有可能是微卫星位点中无效等位基因的存在[22]，使试验分析过程中把杂合子当作纯合子而导致结果中纯合子过剩，从而影响哈迪-温伯格平衡。 天津地区日本沼虾群体间Nei氏遗传距离为0.054 7～0.097 7，小于范武江等[23]的研究结果（0.821 6～0.832 1），遗传分化指数Fst的范围为0.010 4～0.037 7，表明4个群体间遗传距离较近，遗传分化程度处于较低水平。相关研究表明，子代表现型并非随着亲本的遗传距离越大而越好。如鲁翠云等[24]采用微卫星标记指导镜鲤（Cyprinus carpio L.）家系亲本的配组，生长对照结果显示亲本个体间的遗传距离与子一代的生产性能之间相关性较小，遗传距离在0.5～0.7之间的亲本的子一代具有较好的生产性能;毕金贞等[25]在牙鲆（Paralichthys olivaceus）的相关研究中也获得了相似的结果，不同遗传距离范围内，亲本间遗传距离与后代生长速度之间呈现不同的相关性，一些遗传距离很大或者很小的亲本，其后代都表现出比较慢的生长速度。對牙鲆的研究[25]表明遗传距离在0.257 8～0.595 8之间时，亲本间遗传距离越大，后代生长速度则越快;在0.609 9～0.660 4之间时，亲本遗传距离与后代生长速度间没表现出显著的相关性;在0.664 0～0.977 3之间时，亲本遗传距离越大，后代生长速度则越慢。而对合浦珠母贝（Pinctada fucata）的研究[26]表明亲本遗传距离在0.535 5～0.569 6之间时，与子代生长速度呈显著正相关，亲本遗传距离在0.649 6～1.000 0之间时，与子代生长速度呈显著负相关关系。本研究中，4个日本沼虾群体的遗传多态性较高，但相互之间的遗传距离较小，说明在下一步研究中可用这些群体与其他地理关系较远的日本沼虾群体，如鄱阳湖群体、洞庭湖群体等进行远缘杂交，来提高其子代的表现性状。 参考文献： [1]傅洪拓，乔慧，李法君，等.长江不同江段青虾的遗传多样性[J].水产学报，2010，34（2）：204-212.
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