黄芪碱溶多糖的提取及抗氧化活性研究

2019-02-07谢丹丹郑丹张丽霞

天津农业科学 2019年12期

谢丹丹郑丹张丽霞

摘要：为优化黄芪碱溶多糖的提取工艺及其体外抗氧化活性，本研究在单因素试验的基础上，通过正交试验优化黄芪碱溶多糖的提取工艺，并通过Smirnoff法及邻苯三酚自氧化法研究其体外清除自由基能力。黄芪碱溶多糖最优提取工艺条件为提取温度70 ℃、提取时间130 min、料液比1∶20，此条件下提取率为（15.63±0.36）%。为研究黄芪碱溶多糖的抗氧化活性，进行了体外羟基自由基和超氧阴离子自由基清除试验，黄芪碱溶多糖随浓度（0.2～1.2 mg·mL-1）升高，对羟基自由基的清除率先升后降，当浓度为0.8 mg·mL-1时清除率最高为（65.38±0.75）%，显著高于同浓度的Vc处理（P<0.05），亦高于最高清除率的Vc处理（1.0 mg·mL-1）;在低浓度下（0.5，1.0 mg·mL-1）碱溶多糖对超氧阴离子的清除率较高，分别为（49.26±0.06）%和（57.55±0.05）%，显著高于同浓度Vc处理（P<0.05）。由此可见，本文优化工艺大大提高了黄芪多糖的提取率，且提取的碱溶多糖具有较好的抗氧化活性。

关键词：黄芪;碱溶多糖;碱提法;抗氧化活性

中图分类号：R282; O629.12 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.12.005

Abstract： In order to optimize the extraction process and antioxidant activity of Astragalus alkaloid soluble polysaccharide， the extraction process of Astragalus alkaloid soluble polysaccharide was optimized by orthogonal test on the basis of single factor test， and its scavenging ability to free radicals in vitro was studied by Smirnoff method and pyrogallol auxidation method. The optimum extraction conditions were as follows： extraction temperature 70 ℃， extraction time 130 min， liquid ratio 1∶20， and the extraction rate of alkali-soluble polysaccharide was （15.63±0.36）%. In order to study the antioxidant activity of Astragalus alkaloid soluble polysaccharide， the scavenging experiments of hydroxyl radical and superoxide anion radical in vitro were carried out. With the increase of concentration （0.2～1.2 mg·mL-1）， the scavenging rate of hydroxyl radical increased at first and then decreased. When the concentration was 0.8 mg·mL-1， the scavenging rate of hydroxyl radical was the highest[（65.38±0.75）%]， which was significantly higher than that of Vc（P<0.05）， and also higher than the highest scavenging rate of Vc treatment（1.0 mg·mL-1）. At low concentration（0.5 mg·mL-1， 1.0 mg·mL-1）， the scavenging rate of superoxide anion by alkali-soluble polysaccharide was（49.26±0.06）% and（57.55±0.05）%， respectively， which was significantly higher than that of Vc（P<0.05）. Comprehensicely， the extraction rate of the polysaccharide was greatly improved under the optimal condition of this experiment， and the extracted alkali-soluble polysaccharide had better anti-oxidation activity.

Key words： Astragalus membranaceus; alkali-soluble polysaccharide; alkali extraction; antioxidant activity

黃芪（Astragalus membranaceus），又名绵芪，为豆科（Leguminosae）黄芪属（Astragalus）多年生草本植物，主要产于内蒙古、甘肃、黑龙江和山西等地[1]。黄芪多糖是黄芪药用部分的主要活性物质之一，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗衰老、抗氧化、抗炎、抗肿瘤及提高免疫力等多重功效[2-5]。目前有关碱溶多糖的研究已在甜菜粕、茯苓、金针菇等植物中有较多的研究[6-8]，传统的溶剂法虽在工业上是较常用的提取方法，且操作方便，但其存在提取时间长、温度高、会导致活性组分失活、提取率低等缺点。本试验采用碱提法提取黄芪碱溶多糖并优化提取工艺条件，同时对提取的碱溶多糖进行体外抗氧化活性研究，旨在进一步提高黄芪多糖的提取率，为黄芪药理学应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

黄芪购于黑龙江省大庆市让胡路区普济康复医院药房。

黄芪烘干→粉碎→过80目筛（直径0.180 mm）→粉末→真空干燥器备用。

1.2 主要试剂

无水乙醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、碳酸钠、浓氨水、过氧化氢、丙酮、溴化钾、硫酸亚铁、氢氧化钾、水杨酸、三（羟甲基）氨基甲烷、邻苯三酚，所有试剂均为市售分析纯。

1.3 试验仪器

试验所需仪器如表1所示。

1.4 试验方法

1.4.1 碱溶多糖提取流程黄芪粉末→优化1%氢氧化钾溶液提取的条件（提取温度、提取时间、料液比）→离心（3 600 r·min-1，15 min）→合并上清液→100 ℃水浴浓缩至原体积1/3→硫酸中和→透析→水浴浓缩→3倍体积95%乙醇醇沉过夜→无水乙醇、丙酮离心洗涤（3 600 r·min-1，15 min）→干燥器干燥→碱溶粗多糖→冷冻保存。

1.4.2 碱溶多糖红外光谱检测分析天平称取黄芪碱溶多糖2.0 mg，加入溴化钾压片后经傅立叶变换红外光谱仪在4 000～500 cm-1波数范围内扫描。

1.4.3 碱溶多糖含量测定方法采用苯酚硫酸法[9]，用分光光度计在490 nm波长处测定其吸光度，用回归方程计算出碱溶多糖含量，并计算其碱溶多糖得率。

（1）葡萄糖标准曲线的绘制。精确称量干燥至恒质量的无水葡萄糖于容量瓶中，定容。分别量取葡萄糖标准溶液，制成一定浓度梯度于干燥试管中，补加蒸馏水至相同体积，蒸馏水为空白，分别加6%苯酚0.5 mL，浓H2SO4 2.5 mL，立即摇匀，室温静置10 min后于490 nm测定光吸收值，每个浓度平行做3次，绘制葡萄糖浓度与吸收值之间的标准曲线。

（2）多糖含量测定。以碱溶多糖取代葡萄糖标准溶液进行（1）试验，测定490 nm吸光度，根据标准曲线计算多糖含量，进一步获得多糖得率，其计算公式为：多糖得率（%）=多糖含量/原料质量×100

1.4.4 碱溶多糖提取工艺条件优化[10] （1）碱溶多糖提取单因素试验。以1%氢氧化钾为溶剂，在其他条件相同的情况下，分别研究提取温度、提取时间、料液比3个因素对黄芪多糖提取率的影响。各因素梯度设置详见表2。

（2）多糖提取的正交试验。在上述单因素试验的基础上，按L934设计正交表进行三因素三水平的正交试验，得出最佳提取条件。

1.4.5 黄芪碱溶多糖抗氧化活性研究（1）羟基自由基（·OH）清除试验-Smirnoff法[11-12]。取25支具塞试管，且每支试管中都加入1 mL 9 mmol·L-1的FeSO4溶液，2 mL 9 mmol·L-1的水杨酸-乙醇溶液，每支试管分别加入不同质量浓度的黄芪碱溶多糖溶液2 mL，最后加入8.8 mol·L-1 H2O2 2 mL，在37 ℃下反应30 min。以蒸馏水作空白调零，在波長510 nm处测吸光值。每个浓度平行做3次，以Vc作对照，计算自由基的清除率，自由基的清除率的计算公式为：

·OH清除率（%）=（ΔA0-ΔAx）/ΔA0×100

式中，A0为空白对照液的吸光度;Ax为加入多糖液的吸光度。

（2）超氧阴离子自由基（·O2-）清除试验-邻苯三酚自氧化法[11-12]。25 ℃水浴中预热的0.05 mol·L-1 Tris-HCl（pH值为8.2）。依次加入不同浓度1 mL的黄芪碱溶多糖溶液和4.0 mL 25 mmol·L-1的邻苯三酚溶液，迅速摇匀，并立刻于波长325 nm处测吸光值，每个浓度平行做3次，以Vc作为对照，计算超氧阴离子清除率。超氧阴离子清除率的计算公式为：

·O2-清除率（%）=（ΔA0-ΔA）/ΔA0×100

式中，A0为空白组，即邻苯三酚的自氧化速率;A为加入多糖溶液后邻苯三酚的氧化速率。

2 结果与分析

2.1 碱溶多糖傅立叶红外光谱检测结果

由图1可知，在3 438.24 cm-1和3 425.00 cm-1处有缔合的-OH伸缩振动吸收峰，具有典型的-OH吸收峰[13];在1 900 cm-1～1 600 cm-1，具有羰基吸收峰，证明是多糖。

2.2 葡萄糖标准曲线的绘制

通过苯酚硫酸法测定，以葡萄糖质量浓度（C）为横坐标，吸光值（A）为纵坐标，绘出葡萄糖C与A值之间的标准曲线，得回归曲线方程A=1.2×10-2C-0.90×10-2（R2=0.999 8），如图2所示。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 提取温度在提取时间为90 min、料液比为1∶15的条件下，研究提取温度对黄芪碱溶多糖提取率的影响。由图3可知，在50～90 ℃，随温度的升高，提取率呈先升后降的趋势，在60 ℃达到峰值，提取率为7.7%，与其他温度处理差异显著（P<0.05）。因此，黄芪碱溶多糖的提取温度选择60 ℃较为适宜。

2.3.2 提取时间在提取温度为60 ℃、料液比为1∶15的条件下，研究提取时间对黄芪碱溶多糖提取率的影响。由图4可知，在50～130 min，多糖的提取率随提取时间的增加呈先升后降趋势，碱溶多糖提取率在110 min达到峰值，为6.9%，与其他提取时间处理差异显著（P<0.05）。因此，提取时间选择110 min较为适宜。

2.3.3 料液比在提取温度为60 ℃、提取时间为110 min的条件下，研究料液比对黄芪碱溶多糖提取率的影响。由图5可知，多糖提取率随料液比的能加呈先升后降趋势，多糖提取率在提取料液比为1∶15时达到峰值，为7.9%，与其他料液比处理差异显著（P<0.05）。因此，料液比选择1∶15较为适宜。

2.4 正交试验结果

通过单因素分析结果，正交试验因素水平，见表3。

由图4可知，各因素对黄芪碱溶多糖提取率的影响程度依次是提取料液比（A）>提取时间（C）>提取温度（B），最优条件为A3B3C3，即提取温度70 ℃、提取时间130 min、料液比1∶20，此条件与正交试验中多糖最大提取率对应的处理组A3B1C3不同，故在最优条件（A3B3C3）下，开展3次验证试验，计算黄芪碱溶多糖平均提取率为（15.63±0.36）%。

2.5 碱溶多糖抗氧化活性研究结果

2.5.1 清除羟自由基（·OH）如表5所示，黄芪碱溶多糖对·OH的清除率均随浓度（0.2～1.2 mg·mL-1）的增加呈先升后降的趋势，在浓度为0.8 mg·mL-1时达到最大（65.38±0.75）%，显著高于同浓度的Vc处理（P<0.05），亦高于最高清除率的Vc处理（1.0 mg·mL-1），表明黄芪碱溶多糖清除（·OH）的活性高于Vc。

2.5.2 清除超氧阴离子自由基（·O2-）如表6所示，黄芪碱溶多糖和Vc对·O2-清除率均随浓度（0.5～3.0 mg·mL-1）的增加，呈先升后降的趋势。其中，Vc在浓度为2.0 mg·mL-1时，对·O2-的清除率达到最大为94.42%，高于碱溶多糖浓度在2.0 mg·mL-1时对·O2-的清除能力;而黄芪碱溶多糖在低浓度（0.5，

1.0 mg·mL-1）下，对·O2-的清除率较高，分别为（49.26±0.06）%和（57.55±0.05）%，显著高于同浓度Vc处理（P<0.05）。表明黄芪碱溶多糖在低浓度下（0.5，1.0 mg·mL-1）清除·O2-的活性高于Vc。

3 结论与讨论

孙英华等[14]、阎力君等[15]、金芬芬等[16]分别采用不同的提取方法提取黄芪多糖，结果表明：提取方法不同黄芪多糖提取率不同，但提取率均未超过10%。梁子敬等[1]、李海欧等[17] 分别采用超声辅助提取法和水回流提取法提取黄芪多糖，结果表明：黄芪多糖提取率分别为6.18%和6.4%，两者的提取率均不高，但这两种方法在提取过程中对黄芪有效成分破坏程度小。李金芳[18]采用水煎煮法确定的最佳提取工艺为：提取时间45 min、提取温度100 ℃、料液比1∶10、提取次数3次，多糖提取率为10.35%。刘永录等[19]采用NaOH水溶液提取法：取黄芪药材400 g，分别加12和10倍量pH值为12的NaOH水溶液煎煮2次，经后续处理，黄芪多糖提取率为7.73%。本试验采用碱提法通过单因素试验和正交试验对黄芪碱溶多糖的提取工艺进行优化，在提取温度70 ℃、提取时间130 min、料液比1∶20，碱溶多糖提取率达（15.63±0.36）%，提高了黄芪的利用率及黄芪多糖的提取率。

李金芳[18]、胡碧君[20]、吴铭等[21]研究结果表明：黄芪多糖具有抗氧化活性，但均未对黄芪多糖的抗氧化活性进行具体研究。Vc可通过逐级供给电子而转变为半脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的过程清除体内自由基，是目前试验研究的标准对照[22]。本试验中，黄芪碱溶多糖在0.2～1.2 mg·mL-1范围内对羟基自由基的清除率呈先升后降，除1.0 mg·mL-1处的其他浓度黄芪碱溶多糖对羟基自由基的清除率均显著高于同浓度Vc处理。对·O2-清除率在低浓度（0.5，1.0 mg·mL-1）下显著高于同浓度Vc处理。因此，黄芪碱溶多糖可应用于医学中与清除自由基有关药物的有效成分或辅料。

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