驱蚊香草离体扩繁系统的建立

王冶，郭九峰*，春霞

（内蒙古大学物理科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010021）

驱蚊香草是澳大利亚植物学家迪克（Drik Van Lenan） 使用植物细胞分离、基因重组融合技术将香茅草中的香茅醛基因融入香叶天竺葵中得到的全新植物，具有良好的驱蚊效果，且对人体无负面影响。驱蚊香草叶子释放出乙酰香茅醛，其芳香气味不仅可以驱逐蚊虫、多种昆虫以及宠物身上的寄生虫，还可以清新室内空气，使人精神振奋[1]。其是一种新型的具有芳香气味且能够驱蚊的常绿环保花卉，目前在国内很多省市栽培并建立了种植基地。驱蚊香草中的主要成分香叶油还对多种动物肿瘤有一定的疗效，对体外瘤细胞有明显的杀伤作用，其中香叶醇等单萜类化合物具有抗癌活性，是一种抗癌药[1]。驱蚊香草累积病毒后，驱蚊效果降低。由于其遗传基础复杂，种子繁殖力低，而扦插栽培技术所要求的扦插苗条件又高[2]，所以，限制了它的应用与推广。组织培养可以保持植物的遗传稳定性，因此，采用植物组织培养方式培养驱蚊香草无疑是最高效的途径。目前已在多种其他植物上采取植物组织培养的方式进行增殖继代[3～10]。前人在驱蚊香草植物组织培养方面进行了大量研究[11]，但诱导结果最佳的外植体类型不尽相同，有人认为是顶芽[12，13]、腋芽[14]和侧芽[15]，有人认为是茎段[16～18]和叶片[19～22]；还有一些人认为叶柄是最佳的外植体材料，污染率和死亡率低，分化出苗的数量最多，有利于驱蚊草组织培养中无菌体系的建立[23～26]。6-BA可以促进芽和愈伤组织的生成，NAA 可以促进细胞分裂，虽然在上述研究中也探索了驱蚊香草植物组织培养的激素配比范围[11～25]，但是驱蚊香草的繁殖效率较低，需要对其快繁技术进行优化。采用驱蚊香草叶柄作为外植体材料，在前人研究的基础上，初步选定愈伤组织诱导培养基成分为MS＋NAA 0.1～0.5 mg/L＋6-BA 0.5～1.0 mg/L＋蔗糖20～30 g/L，在此范围内探索对愈伤组织以及不定芽诱导效果最佳的培养基组成，并建立驱蚊香草离体扩繁体系，旨为驱蚊香草苗木的快速繁育提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以驱蚊香草的叶柄作为外植体。

所用器材有电子精密天平、高压自动灭菌锅、超净工作台、三角瓶（容积250 mL）、培养皿、恒温人工气候室、解剖刀和镊子；试剂有无水乙醇、无菌水、安替福民、萘乙酸（NAA） 和6-苄基氨基嘌呤（6-BA）。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒 选取驱蚊香草健康叶柄，先用洗衣粉水冲洗，然后在流水下冲洗40 min，打开超净工作台紫外灯消毒30 min，吹风30 min；将冲洗好的驱蚊香草叶柄用75%酒精浸泡30 s，取出后用无菌水冲洗，再用10%的安替福民溶液浸泡15～30 min，随后用无菌水清洗叶柄上残留的消毒剂6～8 次，备用。

1.2.2 培养基配制

1.2.2.1 愈伤组织诱导培养基。愈伤组织诱导培养基成分为MS＋NAA＋6-BA＋蔗糖，按照试验设计的的激素与蔗糖含量配制不同的培养基，其中，NAA 含量设0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mg/L 计5 个水平，6-BA含量设0.5 和1.0 mg/L 计2 个水平，蔗糖含量设20和30 g/L 计2 个水平。共得到20 组培养基。

配制愈伤组织诱导培养基1 L，分装在8 个三角瓶中，装入量约150 mL/瓶，调整pH 值至5.8～6.0，然后置于高温灭菌锅中灭菌25 min。

1.2.2.2 MS0生根培养基。培养基成分为1/2MS 26.42 g/L＋蔗糖30 g/L＋琼脂5 g/L，不加任何激素。配制流程同愈伤组织诱导培养基。

1.2.3 愈伤组织和不定芽诱导 用消毒后的手术刀将叶柄切成长1 cm 左右的小段，转接到装有愈伤组织诱导培养基的三角瓶中，接入量为3 段/瓶。试验设20 组培养基处理，每组8 瓶，每组试验均3 次重复。在温度25 ℃、光照时间12 h/d、光照强度1 600 lx 条件下进行培养。

1.2.4 不定根诱导 待不定苗长出2～3 片叶子时转接到MS0生根培养基中，在温度25 ℃左右、光照时间12～14 h/d、光照强度1 600 lx 条件下进行培养。

1.3 指标计算与数据统计

外植体培养后，统计愈伤组织以及不定芽的数量，每组处理均取3 次重复的平均值。根据公式，计算愈伤组织诱导率、不定芽诱导率和扩繁系数：

愈伤组织诱导率＝产生愈伤组织的外植体个数/接种外植体总块数×100%

不定芽诱导率＝产生不定芽的外植体个数/接种外植体总块数×100%

扩繁系数＝1 个周期内分化出的苗数/接种外植体总块数

利用Excel 软件做图。采用SNK 检验法进行数据的差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 最优培养基的筛选

2.1.1 不同培养基对外植体愈伤组织以及不定芽的直接诱导效果 不同培养基处理的外植体愈伤组织以及不定芽诱导效果不同，其中4 号培养基的诱导效果最好（表1）。4 号培养基诱导出的愈伤组织以及不定芽数量均为最多，3 次重复试验共诱导愈伤组织142 个、不定芽288 个，平均每次诱导出愈伤组织47.33 个、不定芽96 个；诱导率最高，其中，愈伤组织诱导率达到了99%，不定芽诱导率达到了96%。

表1 不同培养基对外植体愈伤组织和不定芽诱导效果的影响Table 1 Effects of different medium on explant callus and adventitious bud induction

进一步选取愈伤组织诱导率以及不定芽诱导率均较高的第1、2、3、4、7、8、11、12、16 和20 号共10 组培养基（15 号培养基虽然不定芽诱导率也到达到了与11 号一样的水平，但是愈伤组织诱导率偏低，所以未纳入检验） 进行方差分析，采用SNK 检验法进行指标值的差异显著性检验。结果（表2） 显示，4号培养基处理的平均愈伤组织数量最多，其次是8 号培养基，二者差异不显著，但均与其他培养基处理差异达到了显著水平；4 号培养基处理的平均不定根数量最多，且与其他培养基处理差异均达到了极显著水平。可以看出，4 号培养基（MS＋NAA 0.1 mg/L＋6-BA 1.0 mg/L＋蔗糖30 g/L） 对外植体愈伤组织以及不定芽的直接诱导效果明显好于其他培养基。

表2 不同培养基诱导对愈伤组织以及不定芽数量的影响Table 2 Effects of different media induction on callus and adventitious bud quantity

2.1.2 不同NAA 含量对外植体愈伤组织以及不定芽诱导效果的影响 微量激素即可强烈刺激植物细胞的分裂与生长，本研究中6-BA 设定2 个水平，在培养基6-BA 含量＋蔗糖含量均相同的条件下，分析NAA含量变化对外植体愈伤组织以及不定芽诱导效果的影响。

在6-BA 0.5 mg/L＋蔗糖20 mg/L 不变条件下，随着NAA 含量的增加，外植体的愈伤组织总数量呈先降低后逐渐升高的趋势变化，不定芽诱导总数量呈逐渐降低趋势（图1）。

图1 在6-BA 0.5 mg/L+蔗糖20 mg/L 不变条件下NAA 含量对外植体愈伤组织以及不定芽总数量的影响Fig.1 Effects of NAA content on explant callus and total number of adventitious buds under the condition of 6-BA 0.5 mg/L+sucrose 20 mg/L

在6-BA 1.0 mg/L＋蔗糖20 g/L 不变条件下，随着NAA 含量的增加，外植体的愈伤组织总数量呈先略微升高后逐渐降低的趋势变化，不定芽诱导总数量呈逐渐降低趋势（图2）。

图2 在6-BA 1.0 mg/L+蔗糖20 mg/L 不变条件下NAA 含量对外植体愈伤组织以及不定芽总数量的影响Fig.2 Effects of NAA content on explant callus and total number of adventitious buds under the condition of 6-BA 1.0 mg/L+sucrose 20 mg/L

在6-BA 0.5 mg/L＋蔗糖30 mg/L 不变条件下，随着NAA 含量的增加，外植体的愈伤组织总数量呈先降低后逐渐升高的趋势变化，不定芽诱导总数量呈逐渐降低趋势（图3），指标值变化趋势与6-BA 0.5 mg/L＋蔗糖20 mg/L 不变条件下指标值的变化趋势相同。

图3 在6-BA 0.5 mg/L+蔗糖30 mg/L 不变条件下NAA 含量对外植体愈伤组织以及不定芽总数量的影响Fig.3 Effects of NAA content on explant callus and total number of adventitious buds under the condition of 6-BA 0.5 mg/L+sucrose 30 mg/L

在6-BA 1.0 mg/L＋蔗糖30 g/L 不变条件下，随着NAA 含量的增加，外植体的愈伤组织数量和不定芽数量均呈逐渐降低趋势（图4），指标值变化趋势与6-BA 1.0 mg/L＋蔗糖20 mg/L 不变条件下指标值的变化趋势基本相同。

图4 在6-BA 1.0 mg/L+蔗糖30 mg/L 不变条件下NAA 含量对外植体愈伤组织以及不定芽总数量的影响Fig.4 Effects of NAA content on explant callus and total number of adventitious buds under the condition of 6-BA 1.0 mg/L+sucrose 30 mg/L

2.1.3 不同培养基对外植体扩繁系数的影响 不同培养基处理的外植体扩繁系数不同。这与不同培养基对外植体愈伤组织以及不定芽的诱导效果不同有关。其中，4 号培养基的外植体扩繁系数最大，为5.97。

进一步对愈伤组织诱导率以及不定芽诱导率均较高的第1、2、3、4、7、8、11、12、16 和20 号共10组培养基的外植体扩繁系数进行统计，结果（图5）显示，这些培养基的扩繁系数为5.11～5.97，均高于5。可以看出，愈伤组织诱导率以及不定芽诱导率均较高的培养基，其外植体扩繁系数也较大。

图5 愈伤组织以及不定芽诱导率均较高培养基的外植体扩繁系数Fig.5 Callus propagation coefficient on media with high callus and adventitious bud induction rate

综上分析，本研究条件下，4 号培养基（MS＋NAA 0.1 mg/L＋6-BA 1.0 mg/L＋蔗糖30 g/L） 对外植体愈伤组织以及不定芽的直接诱导效果均最好，扩繁系数最大，为最优培养基。

2.2 最优培养基条件下无性繁殖体系的建立

2.2.1 愈伤组织及不定芽诱导 按既定条件培养10～15 d 后，接种在愈伤组织诱导培养基上的叶柄外植体开始膨胀，表面凹凸不平，有愈伤组织形成，此时愈伤组织呈绿色，与叶柄颜色一致（图6）；培养25～30 d后，有不定芽长出，丛芽密集（图7），芽长1.5～2 cm。除了少数污染和灼烧过的外植体之外，其他每个接种的外植体均有不定芽长出。

图6 愈伤组织形成Fig.6 Callus formation

2.2.2 幼苗繁殖 将无菌苗重新接种于相同的培养基上继续培养，每隔20 d 左右继代1 次；20～25 d 小苗株形成，叶片完全伸展开（图8）。将幼苗转接到生根培养基中，20～30 d 后有白色新根长出，枝茎变长，叶片变大，苗株高5～6 cm，根长3～4 cm，整个苗株生长粗壮（图9），此时即可移栽。

2.2.3 炼苗移栽 将苗株移出气候室，揭开瓶盖，在室温、自然光照条件下炼苗2～3 d。将苗株轻轻取出（避免损伤叶片和根部），放入水中，洗去培养基，选傍晚进行移栽（图10）。移栽后一周内每隔2～3 h 喷水1 次，每日早晚适量浇水，避免长时间阳光照射，及时清除病苗和腐烂苗。

图8 幼苗形成Fig.8 Seedling formation

图9 幼苗长大Fig.9 Seedlings grow up

图10 炼苗移栽Fig.10 Refining and transplanting

3 结论与讨论

3.1 结论

以驱蚊香草的健康叶柄为外植体，在MS＋NAA 0.1 mg/L＋6-BA 1.0 mg/L＋蔗糖30 g/L 培养基上可以直接诱导愈伤组织和不定苗的发生。具2～3 片叶的不定苗放在无任何激素的MS0生根培养基上，一周内可以长出不定根。采用植物组织培养方法扩繁驱蚊香草，一段1 cm 长的叶柄外植体经过2～3 个月后可以得到5.97 个植株。

3.2 讨论

本研究中，从愈伤组织诱导、不定芽诱导到生根诱导，建立了相对完整的驱蚊香草无性繁殖体系，可为驱蚊香草的大规模快速生产提供技术支持。

驱蚊香草在植物组织培养过程中易出现玻璃化现象，表现为叶片蜷缩折皱呈透明状且不易生根，极大地影响植物生长。而6-BA 浓度过高会引起驱蚊香草外植体的玻璃化，为了防止此现象的发生，需适当提高培养基中的糖含量、降低6-BA 含量，并在培养过程中给外植体适当透气。此外，微量激素即可能强烈刺激植物细胞的分化、分裂及生长发育，进而影响植物的生理生化活动，所以在配制培养基时必须精确称取6-BA 和NAA 的用量。

组织培养可以保持植物的遗传稳定性。驱蚊香草是植物体细胞杂交所产生的新植物，利用茎尖、叶片、叶柄和茎段进行快速繁殖都可以使其良好性状得以很好维护。本研究中，选取驱蚊香草叶柄为外植体材料，14 d 左右即可诱导出愈伤组织，愈伤组织诱导率为99%，不定芽诱导率达96%，且生根及炼苗移栽成活率等均较好。本次试验使用的生根培养基与前人研究使用的生根培养基有所不同，采用了未放任何激素的MS0培养基，生根率与不定芽出芽率一致且均很高，平均每个外植体长出的幼苗多达16 个，扩繁系数达到了5.97 倍，这也就是说，选取一段长5 cm 的驱蚊香草叶柄，利用植物组织培养方法扩繁后可以得到30 株左右的驱蚊香草，扩繁结果可观。采用植物组织培养方法扩繁驱蚊香草，平均2～3 个月即可得到多株幼苗，极大地提高了扩繁效率。驱蚊香草苗木的快速繁育为乙酰香茅醛等工业化提取奠定了物质基础。