石斛酚对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞的保护作用

张 梅，李春霞，韦 芳，秦 瑜

0引言

据世界卫生组织保守估计，至2035年糖尿病患病率将增加55%，由目前的3.82亿增加至5.92亿[1]。在过去1980/2010的30a中，经过7次全国性糖尿病调查，发现中国大陆糖尿病发病人群增长了17倍，且糖尿病和糖调节异常在中国已成为了流行病[2]。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病并发症之一，在DR的发病过程中主要表现为视网膜血管病变和视网膜神经退行性病变，视网膜上所有细胞都会受到影响，并导致视功能逐渐丧失[3]。石斛是《中国药典》历版所收载的名贵中药材，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效，来源于兰科石斛属多种植物的新鲜或干燥茎。现代研究发现石斛属植物，具有抗肿瘤、免疫调节、抗血小板聚集、扩张血管、抗氧化、抗诱变等多种活性[4]，其主要化学成分为联苄类、多糖、生物碱、菲类、芴酮、香豆素和倍半萜等化合物[5]。石斛酚是一种从石斛中提取出的联苄类化合物，联苄类化合物具有重要的抗肿瘤、抗诱变等生物活性，常被作为衡量石斛药材质量的质控指标。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞及药物人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs，ACBRI181)购自Cell Systems(Kirkland，WA，USA)；石斛酚、依帕司他购自上海源叶生物科技有限公司。石斛酚结构式见图1。

1.1.2试剂M199培养基、胎牛血清、2.5g/L胰蛋白酶、青-链霉素混合液购自Gibco公司；ROS活性氧检测试剂盒购自凯基生物；一抗NF-κB(ab32536)购自Abcam公司，β-actin(60008-1-lg)购自Proteintech公司；二抗羊抗兔(111-035-003)购自Jackson公司；Trizol Reagent购自Invitrogen公司。

1.1.3仪器CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)，流式细胞仪(美国Beckman公司)，酶标仪(美国Thermo公司)，荧光定量PCR检测仪(美国Thermo公司)，紫外分光光度计(上海司乐仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及处理使用含10%胎牛血清的M199低糖培养基(葡萄糖5.5mmol/L)，在37℃，5% CO2条件下培养细胞，每2～3d换液一次。实验分为5组：正常组(葡萄糖5.5mmol/L，NG)、甘露醇组(葡萄糖5.5mmol/L+甘露醇24.5mmol/L，M)、高糖组(葡萄糖30mmol/L，HG)、石斛酚组(葡萄糖30mmol/L+石斛酚5μmol/L，GIG)、依帕司他组(葡萄糖30mmol/L+依帕司他1μmol/L，EPS)。实验组细胞均培养48h。

1.2.2MTS实验检测细胞活力MTS细胞毒性与细胞增殖实验试剂盒是用于测定细胞增殖与毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度、无放射性的比色检测法。HRMECs种植在96孔培养板中，每孔100μL，约1×104个细胞。将石斛酚及依帕司他在糖浓度为5.5mmol/L的培养基中设置出一系列浓度梯度组，每组设6个复孔，置37℃，5% CO2培养箱中孵育24h或48h。然后每孔加入20μL的MTS试剂，37℃孵育2h，用酶标仪在490nm波长处检测每孔的光密度(OD)值。细胞活性=处理组OD值/对照组OD值×100%。

1.2.3ROS检测活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测的试剂盒。HRMECs种植在6孔培养板中，置37℃，5% CO2培养箱中培养，待细胞达70%融合状态后，将实验分为正常组、甘露醇组、高糖组和石斛酚组4组，孵育48h，然后去除培养基，在避光条件下用无血清培养基按照1∶1000稀释DCFH-DA，每孔不少于1mL，置于37℃孵育30min。收集细胞，用PBS清洗3次，将细胞重悬于300μL预冷的PBS中，送流式细胞仪，使用488nm激发波长，525nm发射波长检测细胞ROS的活性。

图1石斛酚化学结构式。

1.2.4qRT-PCR检测mRNA的表达各组细胞处理结束后，采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度计测D260/280的值，估算RNA的纯度，并测RNA浓度，计算RNA含量，将其逆转为cDNA，在荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR检测醛糖还原酶(aldose reductase，AR)、缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的基因表达情况。引物序列：AR前链：GTC CAA AGG CAT CGT GGT GA；后链：AGC AAT GCG TTC TGG TGT CA；HIF-1α前链：TGC TTG GTG CTG ATT TGT GA；后链：GGT CAG ATG ATC AGA GTC CA; VEGF 前链：AAG GAG GAG GGC AGA ATC AT；后链：ATC TGC ATG GTG ATG TTG GA；β-actin前链：GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG；后链：AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG。反应条件：预变性(95℃ 30s)，PCR反应(95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环)，溶解曲线(95℃ 15s，60℃ 60s, 95℃ 15s)。结果处理：△Ct=Ct目的基因- Ct内参基因，△△Ct=△Ct处理组-△Ct对照组，以 2-△△Ct值作为目的基因mRNA的相对表达量。

1.2.5Westernblotting检测相关蛋白的表达检测核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的蛋白表达，正常组、甘露醇组、高糖组、石斛酚组、依帕司他组细胞处理结束后，用PBS洗3次，RIPA裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度。定量20μg上样，10% SDS-PAGE凝胶电泳100mV恒压，70mV恒压转模，封闭，加一抗NF-κB(1∶5000)，4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，再加辣根过氧化物酶标记的二抗IgG室温孵育。TBST洗膜后ECL显影曝光。用Image J软件分析，并计算各组光密度与β-actin光密度的比值，分析蛋白的相对表达水平。

1.2.6细胞划痕实验细胞划痕实验是一种检测细胞迁移与修复能力的实验。HRMECs种植在12孔培养板中，待细胞达90%融合状态后，在每孔中均匀地划出十字空隙，分为正常组、甘露醇组、高糖组和石斛酚组4组，置37℃，5% CO2培养箱中孵育48h。在倒置显微镜下分别在药物开始处理后的0、24、48h拍照，用Image J软件统计细胞迁移面积，并计算细胞的愈合率，愈合率=(处理后面积-0h面积)/0h面积×100%。

图2石斛酚对细胞活性的影响A：不同浓度石斛酚作用于细胞24h；B：0～20μmol/L的石斛酚作用于细胞48h；C：0～10μmol/L的依帕司他作用于细胞48h。aP<0.05vs对照组。

图3高糖诱导内皮细胞发生氧化应激反应A：流式仪检测各实验组ROS的表达活性；B：各实验组ROS的平均荧光强度，aP<0.05vs正常组；cP<0.05vs高糖组。

2结果

2.1石斛酚对细胞活性的影响MTS实验结果见图2A显示，一系列浓度梯度的石斛酚作用于HRMECs 24h，各组细胞活性差异无统计学意义(F=0.860，P=0.574)。选取0～20μmol/L石斛酚孵育细胞48h，结果见图2B，各组细胞活性差异有统计学意义(F=5.321，P=0.015)。20μmol/L石斛酚组与对照组比较，20μmol/L石斛酚组细胞活性明显下降，差异有统计学意义(t=3.959，P=0.003)；1～10μmol/L石斛酚组与对照组比较，5μmol/L石斛酚组细胞活性最高，其活性与对照组差异无统计学意义(t=0.135，P=0.895)。依帕司他孵育HRMECs 48h，MTS实验结果见图2C，各组细胞活性差异有统计学意义(F=13.225，P=0.002)，10μmol/L依帕司他组与对照组比较，10μmol/L依帕司他组细胞活性明显下降，差异有统计学意义(t=0.587，P<0.001)，0.1～1μmol/L依帕司他组与对照组比较，1μmol/L依帕司他组细胞活性最高，其活性与对照组差异无统计学意义(t=0.096，P=0.366)。

2.2石斛酚对氧化应激的影响各组ROS的荧光强度分布，差异有统计学意义(F=233.844，P<0.001)。高糖组与正常组比较，高糖组ROS明显升高，差异有统计学意义(t=23.888，P<0.001)；石斛酚组与高糖组比较，石斛酚组ROS明显降低，差异有统计学意义(t=5.342，P<0.001)。甘露醇组与正常组比较，差异无统计学意义(t=0.131,P=0.898),见图3。

2.3石斛酚对AR/NF-κB的调控图4A是AR在5组实验组中的mRNA表达结果，各组AR mRNA表达差异有统计学意义(F=4.459，P=0.025)，高糖组与正常组比较，高糖组AR表达升高，差异有统计学意义(t=3.596，P=0.005)；石斛酚组、依帕司他组与高糖组比较，石斛酚组与依帕司他组表达下降，差异有统计学意义(石斛酚组：t=3.178，P=0.01；依帕司他组：t=3.369，P=0.007)。图4B、C是5组Western blotting结果，各组NF-κB蛋白表达差异有统计学意义(F=25.220，P<0.001)，高糖组与正常组比较，高糖组NF-κB表达升高，差异有统计学意义(t=6.916，P<0.001)；石斛酚组、依帕司他组与高糖组比较，石斛酚与依帕司他组表达下降，差异有统计学意义(石斛酚组：t=8.503，P<0.001；依帕司他组：t=7.483，P<0.001)。甘露醇组与正常组比较，差异无统计学意义(AR表达t=0.495，P=0.631；NF-κB表达t=1.417，P=0.187)。

2.4石斛酚对HIF-1α和VEGF的调控图5显示的是石斛酚对细胞中HIF-1α和VEGF的mRNA表达的调节作用，各实验组HIF-1α和VEGF的mRNA表达差异都有统计学意义(HIF-1α表达：F=4.263，P=0.029；VEGF表达：F=39.936，P<0.05)。高糖组与正常组比较，高糖组HIF-1α和VEGF的表达都明显升高，差异有统计学意义(HIF-1α表达：t=3.112，P=0.011；VEGF表达：t=9.877，P<0.05)；石斛酚组与高糖组比较，石斛酚组HIF-1α和VEGF的表达都明显降低，差异有统计学意义(HIF-1α表达：t=3.801，P=0.003，VEGF表达：t=8.051，P<0.05)，甘露醇组与正常组比较，差异无统计学意义(HIF-1α表达：t=0.443，P=0.667；VEGF表达：t=1.405，P=0.198)。

图4石斛酚对高糖诱导的AR/NF-κB的调控A：AR mRNA的表达水平；B：Western blotting法检测高糖下内皮细胞中NF-κB蛋白表达水平；C：NF-κB蛋白的相对表达水平，aP<0.05vs正常组；cP<0.05vs高糖组。

图5采用实时定量PCR检测HIF-1α和VEGFmRNA的表达A：HIF-1α mRNA的表达；B：VEGF mRNA的表达。aP<0.05vs正常组；cP<0.05vs高糖组。

图6石斛酚对细胞迁移能力的影响A：倒置显微镜下观察细胞迁移能力(×100)；B：24、48h各组细胞愈合率比较，aP<0.05vs正常组；cP<0.05vs高糖组。

2.5石斛酚对细胞迁移的影响为探究石斛酚对细胞运动能力的影响，用细胞的愈合率反映其迁移能力。图6A是各实验组细胞在药物作用后0、24、48h的位置，可看到随着时间的延长，各组细胞也在生长，但生长的速度不同。图5B是对各组细胞的愈合率进行统计分析，发现各实验组的愈合率差异有统计学意义(24h：F=15.926，P=0.001；48h：F=5.493，P=0.024)。高糖组细胞在24h和48h时间内生长都是快于正常组的，但只有24h时，差异有统计学意义(24h：t=5.374，P=0.001；48h：t=2.136，P=0.065)。且石斛酚组细胞在24h和48h时间内生长都明显慢于高糖组，差异有统计学意义(24h：t=4.337，P=0.002；48h：t=3.006，P=0.017)。甘露醇组与正常组在24h和48h比较，差异无统计学意义(24h：t=1.054，P=0.323；48h：t=1.724，P=0.123)。

3讨论

代谢异常致血糖升高，而ROS累积会产生氧化应激反应，进而损害视网膜血管，最终发展为DR。据研究，高糖血症损害血管主要通过四条经典途径：(1)多元醇代谢途径；(2)晚期糖基化终末产物途径；(3)蛋白激酶C的激活途径；(4)氨基己糖的激活途径。这些途径都与ROS的过度产生有关，而DR会诱导ROS生成。氧化应激能激活相关细胞信号分子，从而增加基因表达和改变酶的功能，导致视网膜功能受损，如内皮细胞功能异常、周细胞凋亡、血视网膜屏障功能受损、渗透性过高、黄斑水肿、异常新生血管等表现[6-7]。

多元醇通路在DR的发展中起重要作用，而AR是多元醇通路的关键限速酶。AR广泛存在于肾脏、血管、晶状体、视网膜、心脏、骨骼肌等组织器官中，催化葡萄糖转化为不易通透细胞膜的山梨醇，使细胞肿胀、变性、坏死，与糖尿病慢性并发症的发生发展有密切关系[8]。研究发现，石斛酚可作用于AR。石斛酚能延迟晶状体混浊，保持晶状体的透明度，具有抗渗透压和抗氧化的能力，在糖尿病性白内障的治疗中起重要作用[9]。此外，石斛酚可抑制NF-κB通路，减少RAW264.7巨噬细胞中由脂多糖诱导的诱导型一氧化氮合酶和环氧化酶-2的产生[10]。

本研究用30mmol/L葡萄糖建立高糖模型，模拟DR在体内的发病过程。为防止高渗环境对内皮细胞产生影响，特设置甘露醇组，保持与高糖组相同的渗透压环境。石斛酚作为一种从传统中草药石斛中提取的单体，已被证实可作用于AR，但是未在DR中做过有关视网膜微血管内皮细胞的研究。本实验使用HRMECs，可能在病理特征方面更加贴近DR的实际病理变化，便于得出更为接近临床的实际研究结果。有研究发现，依帕司他作为一种醛糖还原酶抑制剂，能通过多元醇通路减少2型糖尿病患者红细胞中某些氧化应激标志物，达到治疗糖尿病及其并发症的目的[11]。本实验中使用石斛酚作用于高糖环境下的细胞，依帕司他作为阳性对照，拟探究石斛酚在DR中是否可以像在糖尿病性白内障中一样，通过抑制AR发挥作用。本研究发现，与高糖组相比，石斛酚与依帕司他都可减少HRMECs中AR mRNA的表达，NF-κB的蛋白表达量也呈下降趋势。实验结果说明石斛酚可能会通过抑制AR/NF-κB通路起到治疗DR的作用。此外，所有实验结果都显示，甘露醇组与正常组比较，差异无统计学意义，说明30mmol/L的高渗状态并未对内皮细胞产生不良影响。

DR是最常见的视网膜血管病，微血管细胞受损导致视网膜缺血缺氧，从而产生新生血管，HIF-1α是新生血管形成过程中的关键因子[12]。HIF-1α作为缺氧反应中的一个调节因子，在临床上尚未发现眼内有明显缺血改变前，视网膜上HIF-1α的表达已增加，HIF-1α表达越多表明视网膜缺血缺氧的情况越严重[13]。HIF-1α可诱导VEGF激活，而VEGF与新生血管的形成有重要关系。实验证明，削弱氧化应激中ROS的产生，可抑制HIF-1α/VEGF 通路激活，从而减少新生血管生成[14]。本研究中荧光探针DCFH-DA结果显示，石斛酚可明显减少HRMECs中ROS的表达，同时其下游的HIF-1α/VEGF通路表达也受到抑制，HIF-1α和VEGF的mRNA表达明显降低，说明石斛酚可改善高糖环境下视网膜缺血缺氧的状态，在对抗氧化应激反应方面有显著效果，并且可能有助于减少DR中新生血管的形成。

综上所述，本研究通过探讨石斛酚对高糖诱导的HRMECs中AR通路和氧化应激的作用机制，发现石斛酚能抑制HRMECs中的AR通路和氧化应激反应，并能对抗VEGF的表达，减少新生血管形成，为临床治疗DR提供了重要的理论依据，但是要将实验结果转为临床成果还需进一步的研究。