五苓散对糖尿病视网膜病变大鼠血-视网膜屏障的保护作用

陈 茜，王 菁，魏 伟

0引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是导致全球视力障碍和致盲的主要原因之一[1]。我国糖尿病高发，据统计患病人数已超过1亿，有关DR的研究也成为相关领域的研究热点[2]。DR早期病理变化是血-视网膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)结构及功能的破坏[3]。近年来，关于中医药防治DR的研究已取得重要进展，主要是通过改善血-视网膜屏障的通透性、视网膜水肿、血供等进行综合治疗，在临床治疗中被广泛认可。五苓散是仲景名方，在《伤寒论》中五苓散原治蓄水证，涉及全身水液代谢问题，对于血-视网膜屏障通透性的变化，治宜利水渗湿为主，兼以温阳化气之法。长期临床应用证实，五苓散对DR引起的血-视网膜屏障的破坏有较好的治疗效果[4]。本研究通过构建糖尿病大鼠模型，观察五苓散对模型大鼠视网膜血管渗透量的影响，初步探讨五苓散对血-视网膜屏障的保护机制。

1材料和方法

1.1材料实验动物：12周龄SPF级SD大鼠50只，雄性，购自南通大学实验动物中心 [许可证号：SCXK(苏)2014-0001]。主要试剂：五苓散(江苏省中医院)；康柏西普(朗沐)；链脲佐菌素(STZ)、伊文思蓝(EB，美国Sigma公司)；大鼠可溶性细胞间黏附分子1 (sICAM-1)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(江苏科晶生物科技有限公司)；大鼠C反应蛋白(CRP)ELISA试剂盒、兔抗鼠血管内皮生长因子(VEGF)抗体(武汉博士德公司)。主要仪器：酶标仪(2300，EnSpire)；微量进样器(5μL，上海高鸽)；血糖仪(索莱宝)；石蜡切片机(RM2135，德国Leica)；组织脱水机(ASF30，德国Leica)。本研究经江苏省中医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1动物分组及造模SD雄性大鼠50只适应性饲养1wk后，随机分为空白组、模型组、高剂量组、低剂量组、阳性对照组，每组10只。模型组、高剂量组、低剂量组、阳性对照组大鼠高脂高糖饲养2wk后，按照体质量腹腔注射STZ 50mg/kg，72h后尾静脉取血，血糖≥16.7mmol/L、尿糖在+++以上者则认为糖尿病大鼠造模成功。空白组大鼠正常饮食饲养2wk后行等量柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。造模成功后，所有大鼠均正常摄食、饮水。

1.2.2药物处理本研究所使用的五苓散由猪苓∶泽泻∶白术∶茯苓∶桂枝=3∶3∶3∶3∶2组成，将药物浸泡30min后煮沸1h，取出药物，将药物残渣加入水后再煮沸1h，将两次药物混合后浓缩至生药含量1g/mL的药液。造模成功1mo后，按照大鼠正常剂量为人体的6.3倍计算，经换算高剂量组和低剂量组大鼠分别按0.74、1.5g/kg剂量灌胃给药，1次/d，连续灌胃12wk。模型组和空白组大鼠采用等量生理盐水灌胃。阳性对照组大鼠右眼球内使用微量进样器注射康柏西普3μL[5]一次。所有处理过程均由固定科研人员完成。

1.2.3血糖和体质量监测分别于给药0、2、4、6、8、10、12wk，测量每组大鼠的体质量和空腹血糖水平。

1.2.4ELISA法检测大鼠血清sICAM-1和CRP的含量药物处理12wk后，大鼠眼眶取血并收集血清。参考试剂盒说明书，将各组大鼠血清加入酶标板上，37℃培养箱中孵育30min，洗涤，加入酶标试剂，孵育，洗涤，每孔先后加入显色剂A和B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min，加终止液50μL，450nm波长处测量各孔的吸光度值，根据标准曲线换算大鼠血清sICAM-1和CRP的含量。

1.2.5EB渗漏试验观察大鼠血-视网膜屏障通透性药物处理12wk后，每组随机选取4只大鼠麻醉后尾静脉注射EB溶液45mg/kg，循环2h后处死大鼠，显微镜下取出右眼球并分离出视网膜，4℃过夜后晾干称重，将大鼠视网膜与150μL甲酰胺于70℃孵育18h。低温离心后取上清液，酶标仪测定620nm和740nm下样品的吸光度(OD)值，并计算差值(净吸光度值)，用视网膜干重(mg)标准化EB(ng)含量。每个样品测量3次取平均值。

1.2.6HE染色观察视网膜组织药物处理12wk后，每组随机选取3只大鼠麻醉处死，摘取右眼眼球，用10%甲醛固定、脱水、透明、浸蜡石蜡包埋，切厚度为4μm的切片。脱蜡后的视网膜经苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察视网膜各层结构并拍照。

1.2.7免疫组织化学染色法观察视网膜VEGF表达药物处理12wk后，每组随机选取3只大鼠麻醉处死，视网膜石蜡切片制作方法同1.2.6。石蜡切片经PBS冲洗，3%过氧化氢37℃孵育5～10min以消除内源性过氧化物酶活性，室温下蛋白封闭液封闭 5min，VEGF抗体(1∶200)4℃封闭过夜，加 HRP 标记的广谱二抗，DAB显色，苏木精复染，封片。显微镜下观察并采用 Image-Pro Plus6.0图像分析软件测定免疫组化视网膜组织累积光密度(integrated optical density，IOD)。

2结果

2.1五苓散对大鼠体质量和血糖水平的影响药物处理前后，各组大鼠体质量和血糖水平比较，差异有统计学意义(体质量：F时间=143.953，P时间<0.001；F组间=210.282，P组间<0.001；F交互=280.769，P交互<0.001；血糖：F时间=3.583，P时间=0.007；F组间=939.474，P组间<0.001；F交互=2.783，P交互=0.003)。给药0wk，模型组、高剂量组、低剂量组、阳性对照组大鼠体质量、血糖水平与空白组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，表明造模成功。随着时间的延长，模型组大鼠体质量呈下降趋势，高剂量组、低剂量组、阳性对照组大鼠体质量变化不明显。给药10、12wk，高剂量组大鼠体质量高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。随着时间的延长，模型组大鼠血糖水平无明显变化。给药10、12wk，高剂量组大鼠血糖水平低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1、2。

2.2各组大鼠血清sICAM-1和CRP的含量模型组大鼠血清sICAM-1和CRP含量均明显高于空白组，高剂量组、低剂量组、阳性对照组大鼠血清sICAM-1和CRP含量均显著低于模型组，高剂量组大鼠血清sICAM-1和CRP含量均低于低剂量组和阳性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。低剂量组大鼠血清sICAM-1和CRP含量高于阳性对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

图1HE染色观察各组大鼠视网膜组织(×400) A：空白组；B：模型组；C：低剂量组；D：高剂量组；E：阳性对照组。

组别只数给药0wk给药2wk给药4wk给药6wk给药8wk给药10wk给药12wk空白组10335.43±15.15375.45±18.40406.03±18.51434.83±17.45462.30±17.29493.59±23.71531.22±21.79模型组10266.11±19.56246.29±18.72235.36±18.16236.10±16.99225.81±16.49217.30±15.83216.03±17.48高剂量组10248.79±20.34232.88±19.26227.56±23.29233.78±21.83239.81±20.97247.62±6.06a248.58±23.36a低剂量组10250.54±19.92230.61±19.28224.56±23.24227.17±22.79232.79±21.80233.48±20.23237.01±18.67阳性对照组10246.86±17.72227.11±16.55221.14±21.59222.50±23.79222.61±21.91224.66±20.72228.51±17.48

注：aP<0.05vs模型组。

组别只数给药0wk给药2wk给药4wk给药6wk给药8wk给药10wk给药12wk空白组105.76±0.415.79±0.555.71±0.465.59±0.525.17±0.565.16±0.395.54±0.33模型组1028.11±2.6128.56±1.9927.97±2.3228.10±2.0327.55±2.6128.00±2.3228.25±1.56高剂量组1029.34±2.5028.15±1.8027.54±2.1226.90±2.4425.99±1.6625.64±1.81a25.56±2.48a低剂量组1027.54±2.5226.75±1.8225.71±2.3427.67±1.6226.96±1.6327.00±1.2826.83±2.47阳性对照组1027.66±2.2727.06±2.5126.69±1.7927.01±1.9127.20±2.3327.4±1.6027.25±2.46

注：aP<0.05vs模型组。

组别只数ICAM-1(μg/g)CRP(ng/mL)空白组104.30±0.231.61±0.40模型组1014.33±0.225.30±0.32高剂量组1011.31±1.423.71±0.40低剂量组1011.94±1.544.13±0.16阳性对照组1011.84±1.614.05±0.24 F91.561230.78P<0.001<0.001

2.3大鼠血-视网膜屏障的通透性空白组、模型组、高剂量组、低剂量组、阳性对照组大鼠视网膜组织EB渗透量分别为4.21±0.43、23.68±0.43、13.71±2.78、15.77±4.15、15.18±2.23ng/mg，差异有统计学意义(F=34.446，P<0.001)。模型组大鼠视网膜组织EB渗透量明显高于空白组，高剂量组、低剂量组、阳性对照组大鼠视网膜组织EB渗透量均较模型组减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。高剂量组大鼠视网膜组织EB渗透量低于低剂量组和阳性对照组，阳性对照组低于低剂量组，但差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.4大鼠视网膜组织病理学检查结果空白组大鼠视网膜各层结构清晰，细胞形态正常，排列有序(图1A)；模型组大鼠视网膜神经节细胞层排列紊乱，呈空泡样，内、外核层水肿，出现空泡样改变，可见血管样结构(图1B)；低剂量组大鼠视网膜神经节细胞见较小空泡，各层组织见轻度水肿，内、外核层细胞排列较疏松、紊乱，可见较大空泡(图1C)；高剂量组大鼠视网膜各层结构和排列较清晰，水肿减轻，较模型组明显改善(图1D)；阳性对照组大鼠视网膜神经节细胞排列紊乱、水肿、溶解，外核层细胞间明显水肿、排列疏松、紊乱(图1E)。

2.5各组大鼠视网膜VEGF表达情况空白组大鼠视网膜中有少量VEGF表达；模型组大鼠视网膜各层均有VEGF表达，视网膜神经节细胞层、内丛状层、内核层及色素上皮层呈深棕黄色；高剂量组、低剂量组、阳性对照组大鼠视网膜VEGF表达下调，外核层可见(图2)。空白组、模型组、高剂量组、低剂量组、阳性对照组大鼠视网膜组织VEGF累积光密度值分别为146.2046±45.2672、1090.5060±131.2153、644.8474±36.4814、814.8597±26.5625、594.8474±27.3713，差异有统计学意义(F=81.163，P<0.001)。高剂量组、低剂量组、阳性对照组大鼠视网膜中VEGF表达量均低于模型组，高剂量组、阳性对照组大鼠视网膜中VEGF表达量均低于低剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)，阳性对照组大鼠视网膜中VEGF表达量低于高剂量组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

图2免疫组织化学染色法观察视网膜VEGF表达(×400) A：空白组；B：模型组；C：低剂量组；D：高剂量组；E：阳性对照组。

3讨论

迄今为止，对于DR的发病机制和代谢通路仍未阐明，炎症反应对DR的发展起到关键作用[6]。机体在持续高糖状态下，糖基化终末产物(AGEs)与其受体(RAGE)结合，激活核转录因子-κB(NF-κB)通道，使sICAM-1表达上调[7]。白细胞黏附于视网膜血管壁可导致血管通透性增强、内皮细胞损伤和毛细血管无灌注，故sICAM-1水平升高是DR最早的病理变化之一[8]。抑制sICAM-1的表达可以明显降低白细胞瘀滞和BRB破坏[9]，延缓DR的进展。研究发现，VEGF表达增加，影响内皮紧密结合蛋白的功能，促使BRB的破坏，VEGF和炎症因子之间的相互作用在DR和糖尿病性黄斑水肿(DME)的发病机制中具有重要的作用[10]。CRP是重要的炎症标志物，是由炎性细胞因子白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)及肿瘤坏死因子(TNF)刺激肝细胞和上皮细胞合成的一种全身性炎症反应急性期的非特异性标志物，目前关于CRP与糖尿病关系的研究越来越受到关注[11]。Nalini等[12]发现在DR进展中，视网膜组织损伤可导致CRP水平升高，与糖尿病无视网膜病变患者比较，DR患者的炎症因子(TNF-α、CRP)水平升高。此外，CRP可促进糖尿病患者体内长期持久的低度炎症反应，进而导致血管内皮损伤，引起微血管病变[13]。

DR属于中医“消渴目病”范畴，主要病因病机为气阴亏虚、脾肾两虚，久致痰湿内生，脉络瘀阻，目失濡养。消渴目病水湿内停导致气滞血瘀，进而加剧DR的进展，使患者视力下降。目前，临床中对于DR和静脉阻塞引起的黄斑水肿的治疗一般采用激光治疗、玻璃体腔注射抗VEGF药物和糖皮质激素治疗等，均取得明显的疗效[14]。中医认为，黄斑属脾，水肿属湿和水停，故辩证为脾肾阳虚、水湿内停、水湿上泛证。五苓散经验方中重用泽泻为君，直达肾与膀胱，利水渗湿。臣以茯苓、猪苓增强其利水渗湿之力。佐以白术健脾以运化水湿，桂枝通阳化气，化气布津。王琦认为五苓散并非专门利尿，更善于化气布津，分消水气，对于水蓄膀胱，水停体内一部分，水逆等均可发挥功效[15]。研究发现，五苓散穴位敷贴治疗脾阳亏虚型痛风，治疗1mo后，CRP显著低于治疗前[16]。

综上所述，五苓散经验方对大鼠体质量和血糖水平无明显影响，虽然不能降低高血糖状态，但是却可以缓解体质量病态性下降。五苓散可以下调血清中炎症因子(sICAM-1、CRP)的表达，降低视网膜组织中EB的渗透量，减轻视网膜水肿，改善血-视网膜屏障功能，抑制DR进展。但是，目前关于五苓散对DR的治疗作用和机制尚处于初级阶段，有待进一步的研究。