芦荟大黄素对培养人成纤维细胞Smad 2与I型胶原表达及细胞周期的影响*

杨成华 程基焱

1 西南医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,四川省泸州市 646000; 2 达州职业技术学院

成纤维细胞主要分布于结缔组织等部位。目前认为，成纤维细胞可以合成和分泌胶原蛋白及产生细胞外基质，在组织愈合、瘢痕产生等过程中扮演主要角色[1-2]。Smad蛋白存在于人和动物多种细胞中，参与调节细胞增殖、分化，对创伤修复等生理病理过程有重要作用，是转化生长因子β(TGF-β)受体复合物的下游信号。Smad蛋白可以将TGF-β信号直接由细胞膜转导入细胞核内。因此，Smad蛋白可能在成纤维细胞参与创伤修复及瘢痕愈合中起到重要的作用。芦荟大黄素(Aloe-emodin)是大黄、芦荟等多种中药的有效成分，属植物型药剂。大黄、芦荟在中国传统医学中已经有了悠久的历史，除了可以用于中医的辨证施治以外，还可以用于保健和日用化工品中，主要功效有利于护发和护肤[3-4]。

本研究通过用体外培养人成纤维细胞，用芦荟大黄素进行干扰，检测芦荟大黄素对成纤维细胞的增殖及对其Ⅰ型胶原蛋白表达的影响，分析芦荟大黄素对成纤维细胞相关生理活动的影响和意义，为成纤维细胞的功能调控、调控机制的研究及创伤愈合、疤痕修复等方面的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及主要试剂、设备 人皮肤成纤维细胞：皮肤来自于西南医科大学附属医院普外科小儿包皮环切术皮肤真皮；芦荟大黄素：上海晶都生物技术有限公司；量子点标记试剂盒：武汉珈源量子点技术开发有限责任公司；Ⅰ型胶原、Smad 2一抗：北京博奥森生物技术有限公司；荧光显微镜：日本 奥林巴斯(OLYMPUS，BX51)公司；BD FACSCalibur流式细胞仪：美国 BD公司。

1.2 细胞培养及分组干扰 将皮肤真皮原代培养，传代，纯化，细胞浓度为1.0×108/L，接种于24孔培养板(铺盖玻片)，即每组24例样本量。培养条件：温度37℃、小牛血清10%、DMEM培养基、CO25%。芦荟大黄素以二甲基亚砜为溶剂溶解稀释，分为3个不同剂量的组别，即低剂量组(50μg/ml treatment group，50-TG)，采用50μg/ml进行干扰；中剂量组(100μg/ml treatment group，100-TG)，采用100μg/ml进行干扰；高剂量组(500μg/ml treatment group，500-TG)采用500μg/ml进行干扰；以及对照组(control group，CG)0μg/ml。48h后终止干扰。取出细胞爬片，90%乙醇固定30min，进入后续实验。

1.3 染色及检测 量子点标记：细胞爬片经0.1% Triton-X 100，3%双氧水处理，滴加1∶100稀释的Ⅰ胶原蛋白一抗(鼠抗鼠)37℃ 4h，滴加1∶100稀释的I胶原蛋白一抗(兔抗鼠)37℃ 4h，PBS洗涤，量子点标记二抗(抗鼠、抗兔)复合物37℃孵育20min，PBS洗涤，甘油封片。荧光显微镜下观察成像并照相，记录观察结果。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期 取培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞成细胞悬液，离心，冰乙醇固定，离心。调整细胞浓度为5×105/ml，PI染液孵育。以488nm氩离子激光激发，每组取8例样本量，应用BD CSCalibur(美国 BD公司)流式细胞仪的FAC Station、Cell QUEST Pro数据处理软件系统进行细胞周期检测和结果分析。

2 结果

2.1 量子点免疫荧光结果 干扰48h后，对照组和实验组Smad 2显示为绿色荧光，Ⅰ胶原蛋白显示为红色荧光(图1、2)。分析结果显示， Smad 2主要表达在细胞核，实验组表达明显增高，与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)；Ⅰ型胶原主要表达细胞质，实验组表达明显降低，与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 免疫染色荧光强度

注：*对照组与实验组之间比较，P<0.05；△对照组与实验组之间比较，P<0.05。结果*1P=0.018,*2P=0.008,*3P=0.011,△4P=0.001,△5P=0.003,△6P=0.003。

图1 Smad 2免疫荧光染色结果(×200)

注：A：CG， B：50-TG， C：100-TG， D：500-TG。

图2 I型胶原免疫荧光染色结果(×200)

注：A：CG， B：50-TG， C：100-TG， D：500-TG。

2.2 成纤维细胞流式细胞仪细胞周期检测结果 对照组、实验组G1期细胞所占比例比较，差异有统计学意义(P<0.05)；S期细胞所占比例，G2期细胞所占比例各组之间比较，无明显变化规律，见表2。

表2 流式细胞仪细胞周期检测结果

注：*与对照组比较，P<0.05,*1P=0.021,*2P=0.013,*3P=0.013。

3 讨论

“无瘢痕愈合”(Scarless Healing)是指哺乳动物在创伤愈合后不留瘢痕的特殊现象，是创伤愈合的理想状态。创伤后瘢痕的产生是由于创伤后大量胶原产生，是多年来困扰广大医患人员的难题。研究证实，人类胎儿无瘢痕愈合是胎儿的成纤维细胞在其特殊生理环境中产生细胞外基质的结果，并主要与成纤维细胞内在特性以及其产生的胶原蛋白类型有关。但无瘢痕愈合过程中并非因为胎儿创伤愈合后的基质中缺乏胶原，而主要是因为胶原在胚胎皮肤中的成分及排列等结构与成年皮肤表现出不同的特征。

胶原主要由成纤维细胞合成并分泌，是结缔组织基质中的主要成分，其中Ⅰ型胶原是创面存在的主要胶原。Smad蛋白家族存在于人和动物多种细胞，对细胞增殖、分化、胚胎发育、创伤修复等生理、病理过程有重要作用。有报道称Smad是转化生长因子β(TGF-β)受体复合物的下游信号。其中Smad 2和Smad 3是介导TGF-β1作用的受体调节Smad蛋白，可能是TGF-β1信号下传的第一个信号分子。因此，Smad 2、Smad 3可能在胚胎无瘢痕愈合中起到重要的作用[1-2，5]。

培养人成纤维细胞的Smad 2、Ⅰ型胶原的免疫荧光检测显示，该细胞在常规培养下均有Smad 2、Ⅰ型胶原蛋白阳性产物。该研究实验结果显示，Smad 2主要表达在细胞核，Ⅰ型胶原主要表达在细胞质。在培养中用芦荟大黄素干扰后，Smad 2实验组表达明显增高，而Ⅰ型胶原蛋白实验组表达明显降低。由此可见，芦荟大黄素可以促进体外培育人成纤维细胞中Smad 2的表达，但是抑制该细胞内Ⅰ型胶原的表达。结合本课题组的前期研究结果，胚胎无瘢痕愈合的主要机制可能为Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达差异及比例与成体成纤维细胞不同。因此可以认为，在体外培养人成纤维细胞中，该机制相似于胚胎成纤维细胞，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达决定成纤维细胞的功能状态不同，从而调控着是否有瘢痕形成的愈合机制。芦荟大黄素对Smad 2、Ⅰ型胶原的调节，也说明其机制可能为通过调控Smad 2信号转导途径，达到调控胶原表达的目的，并对愈合及愈合的方式具有一定的意义[3，5]。

实验中，在一定细胞密度内，成纤维细胞保持不断增殖状态。细胞则总是处于从G1、S、G2 和M期的周而复始的细胞周期中。在细胞周期对应的各阶段，细胞分别进行着DNA复制、蛋白质合成及细胞分裂等重要的生理活动。实验结果显示，芦荟大黄素有明显升高G1期成纤维细胞的比例，G1期细胞比例相对于对照组来说，差异有统计学意义，而S期、G2期细胞比例无明显改变规律。其结果说明，芦荟大黄素对成纤维细胞的细胞分裂的影响，主要在细胞周期的G1期。其G1比例增高，则说明细胞在G1停留时间延长、细胞向G0发展的可能性增大、细胞出现功能相对停滞的可能性增大，则细胞不被活化的可能性增大。结合上述成纤维细胞中Smad 2、Ⅰ型胶原表达的特点及组织创伤后修复的过程及机制，可以推导出芦荟大黄素可以适当抑制成纤维细胞的增殖，并避免创伤后成纤维细胞大量增殖并产生更多的胶原，聚集于创伤处不能降解，从而达到瘢痕组织减少的结果。这可能是大黄、芦荟等含芦荟大黄素的中药可以抑制成纤维细胞的功能，调控无瘢痕愈合的作用机制之一[6]。

综上所述，芦荟大黄素对体外培养成纤维细胞的功能有明显调控作用，可以促进Smad 2的表达，抑制Ⅰ型胶原蛋白的合成。同时，芦荟大黄素可以延长成纤维细胞G1期，从而影响细胞的增殖及活性，可能是芦荟大黄素可以达到调控愈合的作用机制之一。但中药的作用机制研究极为复杂，关于芦荟大黄素对愈合状态的作用机制研究还需要大量的基础实验做进一步深入的研究和探讨。