首例基于CRISPR编辑干细胞的基因治疗

■文/曲喜英 王鹏飞

作为先进、热门的基因编辑技术，CRISPR/Cas9首次在人的造血干细胞中完成对CCR5基因的编辑，并将其成功移植到罹患艾滋病和急性淋巴细胞白血病的患者体内。这是CRISPR/Cas9基因编辑技术在治疗艾滋病的道路上迈出的重要一步，同时为探索CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗其他血液疾病提供了重要的参考和指导意义。

宣判“死刑”的艾滋病被判“无期”

自从1981年发现艾滋病，人们不只是避而远之，甚至达到了“谈艾色变”的惶恐程度，因为这场给全球带来“世纪大瘟疫”的传染和流行性疾病在早期医学上是被宣判为“死刑”的。人们只要得了艾滋病，几乎等同于人的一生会被毁掉。1983年，艾滋病病毒——人类免疫缺陷病毒（HIV）——被分离并被确定为艾滋病病原体，为逆转录病毒中的一种，主要分为两型：HIV-1与HIV-2。艾滋病主要是由HIV-1感染所引起的。HIV-1感染人体后会整合于人体细胞的基因组中，通过人体细胞的基因组复制系统完成自身的复制，最终导致人体的免疫系统受到严重的破坏。因此，艾滋病给社会带来了莫大的恐慌。

华裔科学家何大一首创高效抗逆转录病毒疗法（HAART），俗称“鸡尾酒疗法”，使得一种被早期医学宣判为“死刑”的可怕疾病转变为一种可治疗、可控制的慢性疾病。高效抗逆转录病毒疗法通过3种或3种以上的抗病毒药物联合使用来治疗艾滋病，最大限度地抑制艾滋病病毒的复制，使患者被破坏的免疫功能逐渐恢复，从而延缓患者的病程进展、延长患者的生命，为艾滋病患者的治疗赢得更多的时间。何大一的这一工作给处在黑暗边缘的艾滋病患者带来了曙光，让这些垂死挣扎的患者重拾了生活的信心。何大一因为这一震惊世界的疗法，成为风靡全球的“打败艾滋病”的科学名人，被《时代》周刊选为“1996年度风云人物”。但是，何大一明白，即使抗病毒药物能把艾滋病病毒感染降到最低，总会有病毒逃过药物的猎杀，该疗法并不能彻底清除艾滋病病毒。此外，一旦停止抗病毒药物治疗，艾滋病病毒会卷土重来，反弹到治疗前水平，而反弹的艾滋病病毒将再次成为感染人体的“杀手”。因此，在这之后，研发艾滋病疫苗又成了何大一的下一个重点工作。此外，各国在防治艾滋病方面都倾注了巨大的人力和物力，虽然取得了可喜的进展，但全球仍有很多人感染艾滋病病毒。世界卫生组织（WHO）统计：2017年有180万人新感染艾滋病病毒，近100万人死于艾滋病；2018年有超过3 700万人感染艾滋病病毒。由此可见，攻克艾滋病的道路任重而道远。

黑暗中寻找生机但步履维艰

2008年，一名艾滋病患者体内病毒消失的奇迹给予人们新的希望。患有急性骨髓性白血病的“柏林病人”在接受骨髓供体移植手术后，其体内病毒完全消失，成为迄今为止唯一一名被成功治愈的艾滋病患者。这一举世瞩目的成就成为近10年来国际各界人士所关注和试图复制的焦点。研究人员再次通过干细胞和骨髓移植治疗其他曾接受抗病毒药物治疗的艾滋病患者。这些患者在停止接受抗病毒药物治疗之后，体内的艾滋病病毒载量得以被控制，但突如其来的病毒又一次浇灭了这些艾滋病患者求生的欲望。这不仅仅是对艾滋病患者身体和心理的伤害，更是对正在攻克艾滋病的研究人员的沉重打击。

2019年3月，英国伦敦大学及剑桥大学的研究团队在《自然》（Nature）杂志上发表了世界上第二例艾滋病患者经干细胞移植后病情得以缓解的案例。这名艾滋病患者为了治疗霍奇金淋巴瘤而接受CCR5基因纯合缺失（CCR5Δ32/Δ32）的造血干细胞移植。移植后的16个月，这名艾滋病患者停止使用抗病毒药物治疗。停止用药的18个月，这名艾滋病患者体内的艾滋病病毒载量维持在检测限以下。这名“伦敦病人”病情得以缓解的振奋消息再一次轰动全世界，并引发了各界关于治愈艾滋病相关话题的讨论。

然而，对“伦敦病人”这一实例，该研究的主要负责人拒绝使用“治愈”一词来形容这名艾滋病患者。一部分原因是该研究小组仅仅检测患者血液内的艾滋病病毒载量，未观察及检测其他组织。另一部分原因是研究人员对患者观察的时间尚短，目前仅有的数据不足以用“治愈”一词。倘若2年以后，在这名艾滋病患者体内未见到艾滋病病毒的反弹，他将有可能接近“治愈”的边缘并有望复制“柏林病人”成功治愈的奇迹。

基因编辑技术的出现为艾滋病的基因治疗提供了有力的手段。研究人员通过基因编辑技术对艾滋病病毒感染辅助受体CCR5进行体外编辑，并移植到患者体内成为抵抗艾滋病病毒感染的替代性疗法。

“柏林病人”和“伦敦病人”都是通过移植CCR5基因缺失的供体来攻克艾滋病的典型范例。但是，CCR5基因天然缺失的个体在自然界中存在的概率非常低。据统计，在西欧国家，仅有1%的高加索人群中有CCR5纯合缺失的基因，在亚洲人群中更是极为罕见。因此，寻找CCR5纯合缺失的供体可谓是难上加难。此外，在“伦敦病人”的抗病毒研究中，研究人员也提到了另一例通过CCR5Δ32/Δ32干细胞移植的艾滋病患者病例：该名艾滋病患者在暂停抗病毒药物治疗1星期后，进行了造血干细胞移植。研究人员发现，在移植后的3星期内，这名艾滋病患者体内的艾滋病病毒就开始反弹。研究人员推测，这可能是患者体内的艾滋病病毒发生了变异，以其他途径继续感染人体细胞。对“伦敦病人”来说，是否能够逃离上述难题，我们未知，这些尚需研究人员的持续监测。

夹缝中求生存，艾滋病的基因治疗迎突破

基因编辑技术的出现为艾滋病的基因治疗提供了有力的手段。研究人员通过基因编辑技术对艾滋病病毒感染辅助受体CCR5进行体外编辑，并移植到患者体内成为抵抗艾滋病病毒感染的替代性疗法。

2014年3月6日，来自美国宾夕法尼亚大学的研究人员在《新英格兰医学杂志》（NEJM）上发表了首次通过基因编辑技术改造艾滋病患者自身T细胞来抵抗艾滋病病毒感染的临床试验报道。该项研究是在使用基因编辑技术治疗艾滋病的道路上迈出的第一步，也是至关重要的一步。研究人员通过锌指核酸酶（ZFN）技术对12名艾滋病患者自身T细胞中的CCR5基因进行编辑，并将改造后的T细胞回输到患者体内（每名患者回输100亿个T细胞）。随后，这12名艾滋病患者被分为2组，每组6人。一组一直服用抗病毒药物。另一组在服用抗病毒药物4星期后，停止用药达12星期。结果表明，在停止用药的6名艾滋病患者中，有4名艾滋病患者体内的艾滋病病毒数量显著减少，还有1名艾滋病患者体内的艾滋病病毒检测结果呈阴性。研究人员发现，这是由于该名艾滋病患者体内的CCR5基因存在天然突变。

该项研究提示，自体移植CCR5突变的T细胞能够在中断抗病毒药物治疗期间降低艾滋病患者体内的病毒载量，抵抗艾滋病病毒的感染。这使得人们更加相信，改造T细胞有望使艾滋病患者免于使用抗病毒药物治疗，迈向“功能性治愈”艾滋病的边缘。此外，研究人员更希望，基因编辑技术可以在人的造血干细胞中改造CCR5基因，这样就可以获得更多种类型、更长存留时间的免疫细胞，让艾滋病患者自身可以提供更多的、更持久的抗病毒细胞。为此，在艾滋病的基因治疗领域，实现对人的造血干细胞的基因改造显得尤为必要。

2017年8月，北京大学生命科学学院邓宏魁及其合作团队利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在人的造血干细胞中编辑CCR5基因，其效率为27%。小鼠模型实验显示，经CRISPR/Cas9基因编辑技术改造的人的造血干细胞能够在小鼠模型中重建人的免疫系统，抵抗艾滋病病毒的感染。为了能够更进一步证实CCR5基因突变的造血干细胞可以在人体内抵抗艾滋病病毒的感染，2019年9月11日，邓宏魁再次携手合作团队在《新英格兰医学杂志》（NEJM）上报道了首例利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在人的造血干细胞中编辑CCR5基因，并成功将其移植到罹患艾滋病和急性淋巴细胞白血病的患者体内。

●安全性检测

研究人员利用前期优化的CRISPR/Cas9基因编辑技术对供体造血干细胞中的CCR5基因进行编辑，其效率为17.8%。为了最大限度地提高造血干细胞移植治疗白血病的效率，研究人员将基因编辑的造血干细胞与原始的造血干细胞进行了混合移植。患者在接受造血干细胞的移植之后，出现了常见的移植并发症。经过常规治疗后，这名患者的移植并发症得到了缓解。随后，中性粒细胞和血小板在移植后的第13天和27天分别出现重建；淋巴细胞和T细胞亚群增加，CD4细胞在6个月时恢复到正常范围并保持稳定。在移植后的19个月随访中，患者的急性淋巴白血病病情得到完全缓解，实现了完全的供体嵌合。此外，研究人员发现，经CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑的造血干细胞可以在患者体内存活19个月，且在这19个月内未发现CRISPR/Cas9基因编辑技术对基因组造成的非特异性切割及相关的副作用。

●有效性检测

为了探索该方法治疗艾滋病的有效性，研究人员在得到伦理委员会的批准及患者知情同意的前提下，暂时中断对患者的抗病毒药物治疗。停止用药4星期之后，患者外周血内的艾滋病病毒载量增加到每毫升3×107个拷贝。外周血内的CD4+T细胞数量逐级减少，CD4/CD8比例随之降低。CRISPR/Cas9基因编辑技术改造的CD4+T细胞在总体T细胞的比例从2.96%增加到4.39%，提示该细胞具有一定的生存优势及对艾滋病病毒的抵抗能力。然而，该项研究中获得的基因编辑造血干细胞占整体干细胞的比例为5%～8%，这势必会影响其抵抗艾滋病病毒感染的能力。为此，邓宏魁表示，无论是基因导入策略还是基因编辑效率，都是未来需要调整和努力的方向。此外，他表示，未来可以考虑仅仅移植经过基因编辑的造血干细胞，从而提高基因编辑的造血干细胞在患者体内的比例。

总之，该项研究是在使用基因编辑技术治疗艾滋病的道路上迈出的第二步，对整个疾病治疗领域来说都是一个振奋人心的消息。它不仅告诉人们，造血干细胞经CRISPR/Cas9基因编辑技术改造后，可以在患者体内持续存活且没有负面影响，还为人们利用造血干细胞移植技术治疗艾滋病提供了宝贵的信息和经验。此外，该项研究与之前出现的有悖科研伦理的“基因编辑婴儿事件”完全不同，它是在严格遵守伦理规范并取得受试对象的知情同意下才开展的，是以体细胞为靶标展开的基因治疗，在学术界是被认可的。虽然这项研究在艾滋病治疗方面并未取得全面的胜利，但是随着人们对造血干细胞认识的不断加深，以及对基因编辑技术导入系统的不断完善，会给诸如艾滋病一类的血液疾病和免疫系统的疾病治疗带来新的推动和深远的意义。