绞股蓝皂苷类成分的超高效液相色谱指纹图谱研究

2019-01-26黄盼盼马临科唐登峰赵维良

中国药业 2019年3期

黄盼盼，马临科，唐登峰，赵维良 △

（1.浙江中医药大学，浙江杭州 310053； 2.浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州 310052）

绞股蓝Gynostemma pentaphylum（Thunb.）Mak.是葫芦科Cucurbitaceae绞股蓝属Gynostemma的干燥地上部分，产于我国陕西南部和长江以南各省区，生于山坡疏林、灌丛中或路旁草丛中，本种入药，有消炎解毒、止咳祛痰的功效［1］。其药用成分主要为皂苷类和黄酮类物质，以及氨基酸和多糖类等成分，其中绞股蓝皂苷有抗疲劳、促进细胞新陈代谢、增强免疫力等多种生理活性［2-5］。目前，关于绞股蓝药材皂苷类物质的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱尚未见报道。本研究中建立了UPLC绞股蓝皂苷类物质的指纹图谱，并对浙江、四川、陕西和湖南4个产地的绞股蓝药材进行比较分析，为绞股蓝药材及其饮片的质量控制提供了科学依据，同时为其产地研究提供了研究思路。

1 仪器与试药

仪器：ACQUITY H-Class型超高效液相色谱仪（包括四元溶剂管理器、PDA检测器，上海沃特世科技公司）；Milli-Q Advantage A10型超纯水机（美国Millipore公司）；Elmasonic P 300型超声波清洗器（德国Elma公司）；XPE205型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；Minispin 12 000转离心机（德国Eppendorf公司）。

试药：绞股蓝药材购于浙江武义寿仙谷药业有限公司提供，经浙江省食品药品检验研究院主任中药师郭增喜鉴定为葫芦科植物绞股蓝Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Mak.的干燥地上部分，采收于2017年7月或9月（S2于9月），详见表1。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，均购于Merck公司；水为超纯水。

表1 绞股蓝药材来源

2 方法与结果

2.1 UPLC 分析

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱，程序见表 2；流速：0.2 mL ／min；检测波长：203 nm，柱温：30℃；进样量：2 μL。吸取S3批制备的供试品溶液2 μL，按上述色谱条件进样分析，色谱图见图1。

表2 流动相梯度洗脱表

图1 超高效液相色谱图

2.1.2 溶液制备

取绞股蓝干燥地上部分粉末（过4号筛）1.7 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25 mL，超声处理（功率 250 W，80 kHz）30 min，放置至室温，用 70%甲醇补足丢失质量，取2 mL供试品上清液，以转速为13 000 r／min 离心 5 min，取上清液用 0.22 μm 微孔过滤，即得供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

精密度试验：精密吸取S3批供试品溶液，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，选取S峰作为参照峰，计算其他特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各特征峰相对保留时间的RSD为0.23%（n＝6），相对峰面积的RSD为2.12%（n＝6），表明该方法精密度良好，符合指纹图谱技术要求。

稳定性试验：吸取S3批供试品溶液，按拟订色谱条件在 0，2，4，8，12，24 h 时进样，以 S 峰作为参照峰计算其他特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各特征峰相对保留时间的RSD为1.01%（n＝6），相对峰面积的RSD为1.43%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取S3批绞股蓝药材，依法制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件分别进样测定，记录色谱图。结果各特征峰的相对保留时间的RSD为0.10%（n＝6），相对峰面积的RSD为 1.29%（n＝6），表明该方法重复性良好，符合指纹图谱技术要求。

2.2 指纹图谱分析

皂苷类成分指纹图谱的建立：取S1-S16批样品，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，按照拟订色谱条件进样分析，记录色谱图，将所得色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版（以下简称2012年版评价系统）进行分析，选择S1批绞股蓝药材作为参照图谱，其指纹图谱见图2。根据以上分析结果，取S1-S10批绞股蓝药材作为模板药材建立指纹图谱，选择S1批作为参照图谱，进行峰匹配，建立的指纹图谱见图3，多点校正后经自动匹配生成的对照指纹图谱见图4。

图2 16批样品指纹图谱

图3 S1-S10批指纹图谱

图4 S1-S10批对照指纹图谱

特征指纹峰的标定：根据相对保留时间标定特征指纹峰，对模板S1-S10批绞股蓝UPLC测定结果进行比较，发现9个特征峰为S1-S10批绞股蓝药材共有的，因此确定这9个峰为特征指纹峰，计算其他特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见表3。

相似度评价：2012版评价系统中，对16批绞股蓝药材进行相似度评价分析，其中以S1-S10批作为模板药材建立指纹图谱，生成对照图谱并进行相似度评价，采用S1批样品色谱图作为参照图谱。其中，S1-S10批绞股蓝药材的UPLC指纹图谱见图3，多点校正后经自动匹配生成的对照指纹图谱见图4。结果16批绞股蓝药材相对于对照图谱的相似度见表4。

表3 S1-S10批绞股蓝指纹图谱中共有特征峰相对保留时间及相对峰面积

表4 绞股蓝指纹图谱相似度结果

3 讨论

3.1 UPLC分析优势

绞股蓝药材皂苷类成分复杂，HPLC分析需要较长的分析时间（70 ～80 min）才能获得较理想的分离效果［5］。UPLC分析仅需30 min且分离情况理想，在填补了UPLC建立绞股蓝药材指纹图谱的空白的同时，分离效果上也比已报道绞股蓝药材的研究有了提高［6］。

3.2 色谱条件考察

考察了不同浓度溶剂甲醇（50%，70%）、不同溶剂体积（25 mL和50 mL）、不同提取方法（超声、回流）和提取时间（30 min，45 min，60 min）的影响［7-8］，结果以25 mL甲醇超声提取30min的提取效果最好。

考察不同流动相系统（甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸、甲醇 -0.1 磷酸、乙腈 -水、乙腈 -0.4% 磷酸、乙腈-0.1%磷酸）、检测波长（203 nm和254 nm）和不同流速的影响。结果显示，乙腈-水的洗脱能力较强且分离度、峰形较好，检测波长为203 nm，柱温为30℃，流速为0.2 mL／min时，色谱峰基线平稳、分离度好，可更好分离绞股蓝皂苷各成分，因此采用梯度洗脱方式进行分析。