皮革肾岛衣一个聚酮合酶基因的克隆与鉴定

原晓龙, 华 梅, 陈 剑, 张传光, 王 毅

(云南省林业科学院/云南省森林植物培育与开发利用重点实验室/国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室,云南 昆明 650201)

聚酮化合物(polyketides)广泛存在于细菌、真菌和植物中，是一类由聚酮合酶(polyketides synthases，PKS)催化简单单体分子(乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A)间通过连续的缩合和延伸形成的一类次生代谢产物，其种类繁多、结构多样、生物活性广泛[1].聚酮化合物包括大环内酯类、四环素类、蒽醌类和聚醚类等[2]，具抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制剂等生物活性[3]，在临床和农业生产方面具有广泛的应用[3-5].聚酮合酶在真菌次生代谢过程中具有重要作用，能够催化合成许多具活性的聚酮类化合物[6-7].随着二代测序技术的迅速发展，人们已经获得了大量的真菌基因组和聚酮合酶基因数据[8]，仅通过基因敲除[9]和异源表达[10]确定了部分基因的功能，而对其合成机理目前尚不清楚[8].

真菌PKS是一个巨型多功能蛋白，依据其结构和催化方式可将其归入Ⅰ型PKS[11].其结构域包括：ACP酰基转移酶结构域(SAT)、酰基转移酶结构域(AT)、酰基转移蛋白结构域(ACP)、酮酯酰基合酶结构域(KS)、酮酯酰基还原酶结构域(KR)、烯酰基还原酶结构域(ER)、脱水酶结构域(DH)、甲基转移酶结构域(MT)和硫酯酶释放结构域(TE)、这些结构域可在次生代谢产物合成的循环过程中重复使用[2,12].依据聚酮中间体的β-侧链酮基的还原程度，可将真菌Ⅰ型PKS分为非还原(non-reducing, NR)、部分还原(partially reducing, PR)和高度还原(highly reducing, HR)聚酮合酶[8,13]，其中PT和SAT结构域是真菌NR-PKS所独有的，而缺少ER、KR和DH结构域[13].真菌NR-PKS能够催化合成芳香聚酮和大环内酯聚酮，芳香聚酮包括黑色素[14]、苔色酸[9]等；而大环内酯聚酮多为14～16元大环内酯类抗生素，如红霉素及其衍生物等[15].真菌Ⅰ型PKS中AT控制延伸单元但不能控制聚酮链的长度，其长度可能由KS控制[16].

本研究以地衣型真菌(lichen forming fungus, LFF)皮革肾岛衣(Nephrmopsispallescens)的转录组数据为基础进行挖掘分析，通过RT-PCR首次克隆得到1条Ⅰ型PKS基因的全长cDNA序列(NpPKS2)，并对其进行生物信息学分析，比较NpPKS2在不同培养基上具体表达情况，以期为LFFN.pallescens中的聚酮合酶基因的挖掘以及研究异源表达LFFN.pallescens中的聚酮产物提供依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

LFFN.pallescens由韩国地衣资源中心赠送，将其接种到MY培养基并置于15 ℃的恒温培养箱中进行扩繁.

1.2 方法

1.2.1NpPKS2基因全长cDNA的克隆 以LFFN.pallescens的转录组数据为基础，挖掘出1条Ⅰ型PKS基因序列.以这条PKS基因序列为模板利用Primer 5.0设计得到扩增引物NpPKS2F(5′-ATGGCGGATTTGCAGATG-3′)、NpPKS2F(5′-TTTAATCATTTCAACGCC-3′).收获LFF皮革肾岛衣菌丝团0.5 g，采用RT-PCR以NpPKS2F、NpPKS2F为引物，利用高保真DNA聚合酶(TaKaRaTM)克隆该基因，回收纯化后将目的片段与pUC18克隆载体连接，然后置于含有Amp+的平板培养基上进行筛选培养，将含有目的片段的阳性克隆测序，并将该基因命名为NpPKS2.

1.2.2 NpPKS2基因及其蛋白氨基酸的生物信息学分析 利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的在线程序ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测开放阅读框，用BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)程序对其蛋白序列及核酸序列进行同源性比较和分析，用CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)数据库搜索该蛋白的结构域，用ProtParam (http: / /web. expasy.org /protparam/)预测NpPKS2蛋白的分子量、等电点等理化性质，用Target P预测该蛋白作用的细胞位置，并用SignalP 4.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析该蛋白是否含有信号肽.选择真菌中与NpPKS1蛋白序列同源性较高，且已经过功能鉴定的基因的蛋白序列共16条，通过MEGA 6.0多序列比对后，采用邻位相接法(Neighbor-Joining)、自检重复1 000次，其余采用系统默认值构建分子系统发育树.

1.2.3NpPKS2基因在不同培养基上的荧光定量表达分析 将从MY培养基上收获的LFF皮革肾岛衣菌丝团重新接种LMG、BMG、SMGY、YMG、TMG、MY、PMG等培养基(表1)上，15 ℃恒温条件下培养30 d后，分别从各培养基上收获0.5 g该型真菌的菌丝团，3次重复取样.

表1 试验中所用培养基Table 1 The medium used in the study

收获筛选培养基上的样品后，提取真菌总RNA，选择质量较好、浓度合适的总RNA进行反转录.然后以其cDNA为模板，以TPKS2F(5′-TACTTGACTAGTGTATTAAAGG-3′)和TPKS2R(5′-ATCTCTTTTGTTGAGATG-3′)作为检测引物，用qPCR技术检测LFFN.pallescens中NpPKS2基因在不同培养基上的具体表达情况.

2 结果与分析

2.1 NpPKS2基因全长cDNA的获得

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后发现该DNA片段长约6.5 kb；测序后发现该片段长6 249 bp.将该DNA片段通过NCBI上的BLASTN进行比对发现，仅有1条DNA序列与其相似，为玉米炭疽病菌(Colletotrichumgraminicola, XM_008102519.1)的Ⅰ型PKS基因，其一致性为73%，推测该基因是一种新型的真菌聚酮合酶基因.

2.2 NpPKS2基因及其蛋白氨基酸序列的生物信息学分析

获得NpPKS2基因的全长cDNA后，采用常规的生物信息学分析方法对其进行分析，结果显示：该基因的开放阅读框可编码2 082个氨基酸，其蛋白质的相对分子质量为226.87 ku，理论等电点为5.64，蛋白质分子中含有酸性氨基酸残基(Asp+Glu)数量为236个，碱性氨基酸残基(Arg+Lys)数量为189个，结构式为C10035H15780N2672O3061S87，脂肪族氨基酸指数为84.70，总平均亲水性为-0.152，不稳定系数(Ⅱ)为44.90，属于不稳定蛋白；不存在跨膜结构和信号肽；该蛋白在细胞质基质中发挥功能；该蛋白含有6个呈线型排列的结构域，其排列顺序为SAT-KS-AT-PT-ACP-TE，各个结构域的活性保守位点分别为(图1)：SAT(ACP酰基转移酶结构域)(T(I/V)IGPPSVL)、KS(β-酮基合成酶结构域)(IA(I/F)VGM-(E/Q)FWD)、AT(乙酰辅酶A转移酶结构域)(GHSE(A/G)AAG)、PT(产物模板结构域)(SPYWGE)、ACP(酰基载体蛋白结构域)(A(E/D)LGVDSIM(A/S)IE)、TE(硫酯酶释放结构域)(GGFS(A/G)G)；系统进化树结果显示：该系统进化树分为4个独立分支，其中NpPKS2与马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei, EEA25563)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans, AN7909)、灰霉病菌(Botryotiniafuckeliana, XP_001559596)、赤霉病菌(Gibberellazeae, ABB90282)聚为一支，该分支编码的酶蛋白催化合成非还原型单环芳香族聚酮苔色酸(orsellinic acid)，与其他非还原型聚酮化合物形成不同的分支.据此可推测NpPKS2基因编码非还原型聚酮合酶，其催化产物可能为苔色酸.

2.3 NpPKS2基因在不同培养基上的实时荧光定量表达分析

以TPKS2F和TPKS2R作为检测引物、以各筛选培养基上获得样品的cDNA为模板的实时荧光定量PCR检测NpPKS2基因的检测结果显示(图3)：NpPKS2基因在同样的温度条件下，在不同培养基上的表达量差异极其显著，其表达量从高到低依次为BMG(43.7)、TMG(11.4)、SMGY(10.2)、YMG(4.5)、MY(3.3)、BD(1.4)、LMG(1.0).

3 讨论

通过生物信息学分析方法能够对分离得到的基因进行预测和分析.本试验克隆得到LFF皮革肾岛衣中1个NR-PKS基因NpPKS2，发现其结构域为SAT-KS-MAT-PT-ACP-TE，是组成NR-PKS的典型结构域；NR-PKS通常含有1个SAT结构域作为简单分子的起始选择单元[9]， PT结构域也可作为识别NR-PKS的特征结构域[17].分子系统进化树分成了4个独立分支，其中CladeⅠ含有在烟曲霉(A.fumigatus)中编码分生孢子色素的albA基因(AAC39471)，通过基因敲除试验证实albA基因的产物为蓝绿色的分生孢子色素[18]，构巢曲霉(A.nidulans)中的wA基因(CAA46695)，经过wA基因的突变体验证该基因的产物为分生孢子色素[19]，可推测CladeⅠ分支的目的产物为分生孢子色素.在CladeⅡ中，丝状真菌Glarea lozoyensis敲除pks1基因(AAN59953)的突变体表型为白化体，证实pks1基因的产物为黑色素[20]，推断该分支的目的产物为黑色素.Clade Ⅲ的构巢曲霉(A.nidulans)通过缺失AN7909基因的突变体和野生型比对发现该基因的目的产物为苔色酸[9,21-22]，用同样的方法发现禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)pks14基因(ABB90282)参与苔色酸合成[23-24]，据此可推断该分支催化产物为苔色酸.Clade Ⅳ分支，在红曲霉(Monascuspurprueus)中比较含pksCT基因(BAD44749)的野生型菌株与缺失pksCT基因的菌株确定了该基因参与橘霉素的合成，是一种由苔色酸为前体合成的大环内酯类[25].综上所述，地衣型真菌皮革肾岛衣NpPKS2聚在Clade Ⅲ中，可推断NpPKS2很可能参与革肾岛衣中苔色酸的生物合成.

Np:皮革肾岛衣(Nephromopsis pallescens);Gl:Glarea lozoyensis;Fm:Fonsecaea multimorphosa;Pr:产红青霉菌(Penicillium rubens);Pc:厚垣普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia).图1 NpPKS2蛋白各结构域活性保守位点Fig.1 The active conserved amino acids sites of NpPKS2 in each domain

图2 NpPKS2与其他真菌NR-PKS蛋白序列的分子系统进化分析Fig.2 The phylogenetic analysis of NpPKS2 and other fungal NR-PKS

图3 NpPKS2基因在不同培养基上的具体表达情况Fig.3 Expressions of NpPKS2 gene in different medium

在其它培养条件一致的情况下，采用荧光定量PCR检测NpPKS2基因在不同培养基上的具体表达量，结果表明BMG培养基能够强烈诱导该基因的表达，且与其它培养基上的表达量差异巨大，这些现象也表明存在其他真菌的OAS基因簇中，如在构巢曲霉(A.nidulans)中编码苔色酸的orsA基因同样受到生长条件和培养基的影响[9].这可能与大多数聚酮化合物的生物合成基因簇在实验室条件下是沉默的有关[22]，为了改变这一现象通常可通过在异源宿主中过量表达[26]、在生物合成途径中进行异位表达[27]、表观遗传[10]或通过“一菌多产物(one strain many compounds, OSMC)”[28]来获得目的聚酮产物.本文从LFF皮革肾岛衣中克隆得到NpPKS2基因，推测其功能并比较该基因在不同培养基上的表达，为下一步该基因功能确定以及通过异源表达大量获得苔色酸提供前期基础，同时为其他地衣聚酮产物的表达和鉴定提供借鉴.