圆齿野鸦椿花青素提取工艺优化及抗氧化活性评价

袁雪艳, 黄 维, 陈泽明, 张晓华, 邹小兴, 邹双全

(福建农林大学林学院/自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002)

花青素属于黄酮类物质，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性[1]，是一种潜在的医药资源；另外，花青素是一种安全、无毒的天然色素，在食品添加剂领域极具开发前景.但花青素提纯后，稳定性较差，对pH、光照、温度、金属离子较敏感[2,3]，所以，花青素作为天然色素在工业中的应用受到影响，加之富含花青素的原材料价格较高[4]，因此，寻找并开发富含花青素且价格便宜的原材料极为迫切.圆齿野鸦椿(EuscaphiskonishiiHayata)具有良好的观赏价值和保健功能[5]，在福建、江西已有大规模的人工林及绿化应用[6]，盛果期其挂果量较大，满树红果尤为壮观，是优良的观果树种，但果实的食药价值开发利用率较低.关于圆齿野鸦椿的研究大多集中在繁育体系[7-9]、品种筛选、化学成分研究[10,11]和药理研究[12].研究表明，通常果实呈红色与花青素积累密切相关，红葡萄[13]、红苹果[14,15]、红肉猕猴桃[16]和樱桃[17]等，花青素都是其红色果实的主要色素.调查发现圆齿野鸦椿果实成熟后果皮通红，研究[18,19]表明，圆齿野鸦椿果皮富含花青素，是极具开发潜力的花青素原材料.传统的花青素提取方法为热浸提法，耗费时间长，得率低[20，21]；而微生物破壁法、超临界萃取和酶工程技术等又会产生较高的成本[22]；超声辅助提取法因其成本较低、节省时间且高效率等优点，在花青素提取研究和工业生产中已得到广泛应用.本研究以圆齿野鸦椿果皮为原料，应用超声波进行辅助提取，基于单因素试验结果，设计正交试验，优化圆齿野鸦椿果皮花青素的提取工艺条件；并对圆齿野鸦椿果皮花青素的抗氧化活性进行评价，为综合评价圆齿野鸦椿果皮的深加工提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

2017年10月25日，采集盛花期后160 d的圆齿野鸦椿果实，此时果实已沿背缝线开裂，内外果皮已基本转为红色，达到成熟期.果实采集后将果皮和种子分开，并去除枝条树叶等杂物，放入干冰运回实验室，保存于-20 ℃冰箱备用.

1.2 仪器

KQ-500型超声清洗器由昆山市超声仪器有限公司提供；电子天平由奥豪斯仪器有限公司(上海)提供；Eppendorf移液器由Eppendorf公司(德国)提供；TU-1810紫外可见光光度计由北京普析通用仪器有限责任公司提供；旋转蒸发仪由上海爱郎仪器有限公司提供；酶标仪由赛默飞公司提供；吩嗪硫酸甲酯(PMS)、还原型辅酶Ⅰ、硝基四氮蓝(NBT)均由北京索莱宝科技有限公司提供；DPPH由上海麦克林生化有限公司提供；其它试剂均为分析纯.

1.3 方法

1.3.1 最大吸收波长的确定 待测液用紫外可见分光光度计在400～700 nm波长范围扫描.绘制吸收光谱曲线，并找出峰值.以该波长测定提取液的光密度(D).

1.3.2 花青素的提取及测定 磨样：用液氮将果皮研磨至粉末状，备用.

浸提过滤：准确称取0.5 g(±0.001 0 g)粉末放入10 mL棕色离心管中，加入提取剂，以超声波辅助浸提，过滤后置于50 mL容量瓶中，滤渣重复提取2次，最后用提取剂定容至刻度.

脱色：吸取2 mL提取液，置于10 mL容量瓶中，分别加pH=1的盐酸—氯化钾缓冲液和pH=4.5的醋酸—醋酸钠缓冲液稀释，摇匀，静置平衡.

比色：将显色液倒入比色杯(10 mm)中，多次少量润洗，再用UV-2550紫外—可见分光光度计测定D.

计算：每个处理在相同条件下重复3次，取平均值，代入以下公式即可算出提取液的花青素含量.

花青素含量/(mg·g-1)=ΔDVFM×1 000/(εm)

式中，ΔD为(Dmax-D700 nm) pH 1.0-(Dmax-D700 nm) pH 4.5；V为稀释体积(L)；F为稀释倍数；M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量(449.2 g·mol-1)；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数26 900(L·mol-1·cm-1)；m为样品质量(g).

1.3.3 单因素试验设计 提取条件的相关因素水平参考文献[23].通过试验确定最佳浸提剂(1.5 mol·L-1盐酸+95%乙醇(体积比15∶85)、0.1 mol·L-1盐酸、1%盐酸甲醇)和平衡时间(20、30、40、50、60、70、80、90、100 min)后，以超声温度(冰水、10、20、30、40、50、60、70 ℃)、超声时间(10、20、30、40、50、60 min)、超声功率(120、150、180、210、250、270、300 W)、料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12)为单因素，确定圆齿野鸦椿果皮花青素的最佳超声辅助提取条件.对照：超声温度20℃，超声时间10 min，超声功率100 W，料液比1∶4.

1.3.4 正交试验设计 在上述单因素试验的基础上，优选最佳单因素条件后，选取4个关键因素(超声温度、超声时间、超声功率、料液比)，以花青素含量为考察指标，设计四因素三水平的正交试验.试验设计见表1.

表1 正交试验设计Table 1 Orthogonal experimental design

1.4 数据分析

利用Excle 2010对数据进行计算及图表分析.利用SPSS 19.0软件进行统计分析.

A、B、C分别为1.5 mol·L-1盐酸和95%乙醇(体积比为15∶85)混合液、0.1 mol·L-1盐酸、1%盐酸甲醇提取剂.图1 提取剂对花青素提取量的影响Fig.1 Effect of extractant on anthocyanin extraction

2 结果与分析

2.1 提取剂和最大吸收波长的确定

从图1可知，1%盐酸甲醇和1.5 mol·L-1盐酸+95%乙醇(体积比15∶85)混合液提取花青素的效果显著高于0.1 mol·L-1盐酸，得率分别为3.637和3.567 mg·g-1.

利用可见紫外分光光度计在400～700 nm全波段扫描，在pH=1的缓冲液中，1%的盐酸甲醇提取液和1.5 mol·L-1盐酸+95%乙醇混合液提取液均约在520 nm有吸收峰且无杂峰干扰(图2)；在pH=4.5的缓冲液中，1.5 mol·L-1盐酸+95%乙醇(体积比为15∶85)提取液在400～600 nm范围内平稳延伸，无干扰杂峰出现，能较好地起到模糊校正的作用(图2a)，但1%盐酸甲醇提取液出现较多的杂峰干扰，会严重影响花青素含量的估测(图2b).因此，选择1.5 mol·L-1盐酸+95%乙醇(体积比为15∶85)作为提取花青素的溶剂，在520 nm处测提取液的D值.

2.2 静置平衡时间筛选

改变花青素的pH值，需要静置一段时间，溶液达到平衡后再测定相应的D值.由图3可知，在待测样品中加入pH=1和pH=4.5的缓冲液，常温下静置，随着静置平衡时间的延长，在520、700 nm波长下D的变化趋势基本一致，即在20～30 min内呈急剧上升的趋势，30～90 min出现缓慢上升的趋势，在90 min之后趋于平稳.结果表明，90 min后D趋于平稳，因此本试验的平衡时间为90 min.

2.3 超声优化提取结果

2.3.1 最佳超声温度 图4为超声温度对圆齿野鸦椿花青素得率的影响.低温时(冰水和10 ℃)，花青素的得率普遍较低，而出现冰水温度大于10 ℃，可能是因为固体冰块的超声传导率高于液体.随着温度的升高，花青素的提取量先快速增加到40 ℃，之后增加的幅度变缓，并在50 ℃时达到最大(3.849 mg·g-1)，温度继续升高至60 ℃，花青素的提取量下降为3.467 mg·g-1.

2.3.2 最佳超声时间 在10～30 min内，延长超声时间能显著提高花青素的提取量，最高值出现在30 min，继续延长超声时间，花青素的提取量无显著变化，且超声时间太长不仅会产热，还会破坏部分花青素，不利于花青素的提取(图5).

2.3.3 最佳超声功率 将超声功率从120 W增加至180 W，花青素的得率无显著变化且均为低值，说明超声功率过低对圆齿野鸦椿花青素的提取效果并不理想.超声功率为180～240 W，花青素的得率快速增加；超声功率大于240 W时花青素得率增幅减缓，在270 W出现最高值(3.613 mg·g-1)；继续加大超声功率至300 W，花青素得率急剧下降.说明超声功率过高反而会破坏部分圆齿野鸦椿果皮的花青素，降低花青素得率(图6).

a.1.5 mol·L-1盐酸+95%乙醇(体积比为15∶85)提取剂在400～700 nm内全波段扫描;b.1%盐酸甲醇提取剂在400～700 nm内全波段扫描.图2 不同提取剂的光谱扫描结果Fig.2 Spectral scanning results at different extractions

a.待测样品加入缓冲液(pH=1和pH=4.5)后D520 nm随时间的变化趋势;b.待测样品加入缓冲液(pH=1和pH=4.5)后D700 nm随时间的变化趋势.图3 浸提剂D随时间的变化趋势Fig.3 Changes in the optical density of extractant along time

图4 超声温度对花青素提取的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of anthocyanins

2.3.4 最佳料液比 由图7可知，在料液比为1∶4和1∶6的条件下，提取圆齿野鸦椿果皮的花青素得率最高，过低的料液比(1∶2)不利于花青素的析出；继续加大溶剂的比例，花青素得率呈逐渐下降的趋势.通常溶剂量越大提取量也越大，但是过高的溶剂比例会造成溶剂的浪费，同时可能会把不易溶出的成分提取出来，造成类黄酮提取量下降.

图6 超声功率对花青素提取的影响Fig.6 Effect of ultrasonic power on the extraction of anthocyanins

2.4 正交试验结果

由表2可知，影响花青素提取量因素的排列顺序为：超声温度(A)>超声时间(B)>料液比(D)>超声功率(C)，依据K值和R值评估花青素提取的最佳工艺.结果表明，A1B3C3D2为圆齿野鸦椿果皮花青素提取的最佳组合，即超声温度40 ℃，超声时间40 min，超声功率300 W，料液比1∶6.在最佳提取条件下做6组平行试验，验证圆齿野鸦椿果皮花青素的提取效果，结果显示，在最优提取条件下，圆齿野鸦椿花青素提取量为(3.74±0.058) mg·g-1，略高于正交试验的最高值(3.65 mg·g-1).因此，A1B3C3D2是提取圆齿野鸦椿果皮花青素的最佳提取方法.

表2 正交试验结果1)Table 2 Output of the orthogonal experiment

1)n表示试验重复次数，n=3.

2.5 圆齿野鸦椿花青素体外抗氧化活性

2.5.1 DPPH·的清除能力 加大溶液的质量浓度，抗坏血酸的DPPH·清除率基本稳定在88%左右.圆齿野鸦椿花青素的DPPH·清除率逐渐增高，并在1.6 mg·mL-1接近抗坏血酸，达到84.64%(图8).说明溶液浓度大于1.6 mg·mL-1时，圆齿野鸦椿具有较高的DPPH·清除率，清除能力接近抗坏血酸.

2.5.2 ·OH的清除能力 清除·OH的能力是抗氧化物质的一项重要指标.由图9可知，加大圆齿野鸦椿和抗坏血酸的质量浓度，清除·OH能力在0.1～0.8 mg·mL-1增幅缓慢；在质量浓度大于0.8 mg·mL-1时清除·OH能力急剧增大；质量浓度达3.2 mg·mL-1时，·OH清除率最高，抗坏血酸和圆齿野鸦椿花青素的清除率分别为99.86%和77.86%.

图9 圆齿野鸦椿花青素和抗坏血酸对·OH的清除能力Fig.9 Scavenging ability of E.konishii anthocyanin and ascorbic acid on ·OH

3 小结

以圆齿野鸦椿果皮为原料，在确定最佳提取试剂(1.5 mol·L-1盐酸+95%乙醇，体积比为15∶85)和最佳静置时间(90 min)后，设计超声辅助相关的4个单因素试验(超声温度、时间、功率和料液比)，并在此基础上，设计四因素三水平的组合试验；建立超声辅助提取果皮花青素的最佳工艺条件，即超声温度40 ℃，超声时间40 min，超声功率300 W，料液比1∶6；在该条件下青素提取量为(3.74±0.058) mg·g-1，效果较优，时间短，且浸提液用量少.