超高效液相色谱-串联质谱测定鸡肉中恩拉霉素残留量

杜鑫

(南充农产品质量监测检验中心，四川 南充 637000)

恩拉霉素(enramycin)是由放线菌发酵而制得的一类具有环状多肽结构的饲用抗生素，是由不同种类的氨基酸分子和脂肪酸所组成的有机碱[1].据其环状结构末端脂肪酸种类，恩拉霉素主要分为恩拉霉素 A(C107H138C12N26O31)和恩拉霉素B (C108H140C12N26O31)，其对革兰阳性菌有很强的抑制作用，尤其对肠道有害菌梭菌有特效，具有稳定性高、低毒、低残留，不易产生耐药性等特点[2-3].恩拉霉素常作为禽、猪和鱼的抗生素促生长剂，只需要添加微量就可呈现优良的促生长及改进饲料利用率的作用，是许多国家推荐的动物促生长剂和良好的饲料添加剂[1-5].然而，饲养者为了追求产量，往往超量应用添加，造成动物产品中有害化学残留日益严重，威胁人类健康.

目前，恩拉霉素检测主要有微生物检测法[2，6-7]，但只适用于测定恩拉霉素的酶活力，无法准确定性及定量；曾玉勤等[8]采用HPLC法测定了预混剂中恩拉霉素的含量，线性范围为12.5～200.0 mg·L-1，但不适用于“残留低”特性的恩拉霉素检测.本文基于液相色谱-质谱串联技术[9-12]，建立了鸡肉中恩拉霉素残留量检测方法.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

恩拉霉素A (95%)和恩拉霉素B (85%)标准品购于美国Boc Sciences公司；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱级，购自Fisher公司；浓盐酸(优级纯)购于成都科伦药业公司.

超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(Waters，UPLC Xevo TQ-S)，高速匀浆机(IKA，T25)，摇床(IKA，HS501)，旋涡混合器(IKA，Vortex Genius 3)，高速冷冻离心机(Sigma，3-18KS)，精密电子天平(Mettler Toledo，ML104T/02),氮吹仪(Organomation，N-EVAP112)， 固相萃取装置(Agilent)，固相萃取小柱(Waters Oasis HLB，500 mg/6mL)，玻璃纤维滤纸(Whatman，0.7 μm，Φ 125 mm)，超纯水仪(Millipore，Milli-Q)，50 mL离心管(Eppendorf)以及针孔式微孔滤膜(津腾PTFE，0.22 μm)等.

1.2 样品提取

鸡肉组织切碎，高速均质后，称取(2.00±0.05) g鸡肉样品于50 mL离心管中，加入10 mLV(甲醇)∶V(0.1 mol·L-1盐酸)=5∶5溶液，漩涡振荡10 min，低温离心机10 000 r·min-1离心10 min，将上清液转移至50 mL离心管中，残渣再重复提取一次，合并两次提取液，50 ℃氮吹吹至无有机相.用0.1 mol·L-1盐酸溶液定容至15.00 mL，涡旋混匀，低温离心机10 000 r·min-1离心10 min后，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤，滤液收集后待净化.

1.3 样品净化

HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水及5 mL 0.1 mol·L-1盐酸溶液活化，取待净化滤液10.00 mL过柱，待样品液全部流出后，用5 mLV(甲醇) ∶V(水)=5∶95淋洗，抽干.用5 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，氮气吹干，加入2.00 mLV(甲醇)∶V(0.1 mol·L-1盐酸)=5∶5溶液定容，涡旋混匀后过0.22 μm微孔滤膜，待上机检测.

1.4 仪器检测条件

表1 UPLC流动相梯度洗脱程序

色谱条件：色谱柱为Waters XBridge C18色谱柱(50 mm×3.0 mm，3.5 μm)；柱温：40 ℃；样品室温度：16 ℃；进样量：5 μL.流动相：甲醇(A)+体积分数为0.1%甲酸水溶液(B)+乙腈(C)；超高效液相色谱仪(UPLC)流动相梯度洗脱程序见表1.

质谱条件：电喷雾离子源为正离子(Positive electrospray ionization,ESI+)模式，扫描方式为多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM).毛细管电压3.0 kV，脱溶剂气(高纯氮气)温度为500 ℃，其流量为1000 L·h-1，锥孔气(高纯氮气)流量为150 L·h-1，碰撞气(高纯氩气)流量0.10 mL·min-1，仪器Intellistart智能优化功能得出的仪器参数见表2.

表2 恩拉霉素的仪器检测参数

1.5 标准曲线和检出限

为减少基质对电喷雾离子化效率及离子信号强度的影响，提高准确性，配制基质匹配标准溶液来补偿基质效应.将恩拉霉素混合标准储备液用鸡肉空白基质溶液稀释成浓度为10.00、20.00、50.00、100.00、150.00、200.00 μg·L-1的标准溶液，按1.4节中仪器条件依次进样，以恩拉霉素的质量浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标进行线性拟合得出回归方程和线性相关系数.在目标物最低质量浓度附近添加一系列已知浓度的双份样品，测定其响应信号，用Masslynx V4.1软件计算信噪比(Signal-to-noise ratio，S/N)，以S/N=10作为方法定量下限(The limits of quantification,LOQ)，以S/N=3作为方法检出限(Limit of detection,LOD).

1.6 准确度和精密度

选取空白鸡肉样品进行加标回收试验，以测定浓度平均值(Average,AVG.)与参照值的百分比来表示方法准确度，以测定值的相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)表示精密度.向空白鸡肉样品中加入10.00、100.00及200.00 μg·kg-13个浓度水平的恩拉霉素标准溶液，每个水平设6 个平行质控样品，所有样品均采用1.2和1.3节方法进行提取和净化，按1.4节仪器检测条件测定药物浓度.

1.7 日内和日间精密度

依次向鸡肉空白样品中加入低、中、高3个浓度的恩拉霉素标准液，每个浓度设6个平行质控样品.对样品进行提取和净化上机检测，连续测定3 d，根据每天随行测定的基质标准曲线计算样品的实测浓度，即可计算本方法的日内和日间精密度，从而衡量测定结果的稳定性.

2 结果与分析

2.1 样品前处理

因鸡肉中含有大量的油脂等干扰物，在试样前处理过程，创新性地采用玻璃纤维滤纸过滤提取液中的脂肪和蛋白质等杂质，除去了样品中的大量干扰物，有效解决了样品提取液堵塞HLB小柱问题，提高了柱效和净化效果，减小基质干扰.

2.2 方法选择性

恩拉霉素采用反相液相色谱法分离，减少了共流出物，有效降低了目标物的基质效应.在流动相中加入0.1%的甲酸(体积分数)有助于分析物预形成[M+H]+，从而提高电喷雾离子源在ESI+模式下的离子化效率，抑制基质干扰，提高了方法选择性和灵敏度.从恩拉霉素基质标准溶液图谱、鸡肉空白样品图谱和鸡肉加标样品图谱(图1-图3)中可以看出，恩拉霉素A和恩拉霉素B的保留时间分别为3.55 min和3.60 min，目标物均有较强的分子离子峰强度，峰形及分离度均良好，且没有前沿峰和拖尾峰，鸡肉空白基质响应信号不干扰样品中恩拉霉素的测定.

图1 恩拉霉素基质标准溶液图谱(10.00 μg·L-1)

图2 鸡肉空白样品图谱

图3 鸡肉加标样品图谱(10.00 μg·kg-1)

2.3 标准曲线及检出限

恩拉霉素基质匹配标准曲线在10.00～200.00 μg·L-1范围内线性良好，线性相关系数(r)均大于0.998 2，计算得到方法检测鸡肉中药物的LOQ和LOD，结果见表3，恩拉霉素药物的LOQ和LOD分别为10.00 μg·kg-1和4 μg·kg-1.

表3 恩拉霉素检测的线性范围、r、LOQ和LOD

2.4 方法准确度和精密度

在试验条件下所得结果见表4，恩拉霉素检测的准确度为72.41%～84.47%，RSD为3.02%～4.48%，表明该方法具有良好的准确度和精密度.

表4 方法的准确度试验结果

2.5 日内和日间精密度

在试验条件下，鸡肉中恩拉霉素在日内和日间测定值的RSD均小于5.29%(见表5)，表明方法具有很好的重现性和稳定性，测定结果可靠.

表5 鸡肉中恩拉霉素的日内和日间精密度

3 结 论

建立了采用HLB柱固相萃取净化， UPLC-MS/MS测定鸡肉中恩拉霉素残留量的方法.创新性地使用玻璃纤维滤纸来初步过滤提取液中的蛋白质和脂肪等杂质，有效解决了柱子堵塞问题.采用三重四级杆串联质谱法和基质匹配标准曲线外标法来排除复杂基质干扰，减小基质效应，极大地提高了方法的选择性、灵敏度、准确度及精确度等指标，符合动物源食品中兽药残留检测的方法学要求，可为该类抗生素后续实践过程中残留监控质量控制提供技术参考.