miR-346及L1细胞黏附因子在结肠癌组织中的表达及与临床病理特征的关系

朱恩宇, 郑斯卓, 高 凯※, 石 刚，张 睿

(1.辽宁省中医药研究院 辽宁中医药大学附属第二医院外科,沈阳 110034； 2.辽宁省监狱管理局总医院内科,沈阳 110045； 3.中国医科大学肿瘤医院 辽宁省肿瘤医院结直肠外科，沈阳 110042)

近年来，结肠癌发病率呈上升趋势并趋于年轻化，但在消化系统恶性肿瘤中，随着治疗观念的改变及靶向治疗的发展，晚期结肠癌的治愈率及生存率均获得明显提高[1]。对结肠癌分子生物学机制研究的目的在于对结肠癌进行早期发现、早期诊断、预后分析及探索治疗靶点。L1细胞黏附因子(L1 cell adhesion molecule,L1CAM)在子宫内膜癌、食管癌、结肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中高表达，对肿瘤的转移、浸润及淋巴结转移等具有调控作用[2-4]。微RNA(microRNA,miRNA)是一类长18～22 nt单链非编码RNA，可特异性识别并与靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′非翻译区(untranslated region,UTR)结合，调控靶mRNA降解，阻碍翻译过程，调控恶性肿瘤的生物学功能[5]。本研究对miR-346及L1CAM在结肠癌组织中的表达进行检测，评价其与临床病理特征的关系及两者的相关性，目的在于探讨其在结肠癌中的生物学行为及对结肠癌预后的评估作用。

1 材料与方法

1.1实验材料 选取2016年5月至2017年5月于中国医科大学肿瘤医院病理标本库保存的手术切除结肠癌手术标本68例，包括结肠癌组、癌旁组织及正常结肠组织。BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天科技有限公司，L1CAM多克隆抗体购自美国Sigma公司。实时定量逆转录-聚合酶链反应逆转录试剂盒购自立陶宛Fermentas公司，miRNA提取分离试剂盒、All-in-OneTMqPCR Mix试剂盒购自美国Abcom公司。引物由大连宝生生物技术有限公司设计及合成。

1.2免疫组织化学 组织标本置于10%甲醛中固定24 h，脱水后石蜡包埋，4 μm切片，烘干、脱水、脱蜡、抗原修复。在3% H2O2每片50 mL及37 ℃烤箱25 min，采用磷酸缓冲盐溶液洗3次，每次5 min。加入1∶500一抗后湿盒4 ℃孵育过夜。在室温条件下复温20 min，磷酸缓冲盐溶液洗3次，每次5 min，加二抗37 ℃孵育30 min后二氨基联苯胺显色，苏木素复染5～10 min。自来水洗净后盐酸酒精分化10～20 s，流水冲洗30 min。脱水后透明。二甲苯干燥、中性树胶封片。

1.3实时定量逆转录-聚合酶链反应 取结肠癌组织标本，按RNA分离试剂盒以及Trizol试剂盒操作说明书提取及纯化总RNA，将RNA样本稀释至浓度为1 g/L，采用紫外吸收法检测RNA浓度及纯度。应用变性琼脂糖凝胶电泳法测定RNA完整性。合成样品互补DNA，进行梯度稀释标准品和待测样品的管家基因(β-actin)实时定量逆转录-聚合酶链反应检测，绘制梯度稀释标准曲线DNA模板，实时定量聚合酶链反应进行待测基因的检测，反应体系如下：SYBR Green 1染料10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,脱氧腺苷三磷酸 1 μL,Taq聚合酶2 μL,待测样品互补DNA 5 μL,双蒸馏水30 μL,总体积50 μL。将配制好的聚合酶链反应溶液置于实时聚合酶链反应仪上进行聚合酶链反应扩增反应。反应条件：93 ℃预变性2 min，之后94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，73 ℃ 1 min，共40个循环，最后73 ℃ 7 min延伸。采用ΔΔCt法分析溶解曲线。以miR-346/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)吸光度比值进行分析。

1.4结果判定标准 采用阳性细胞着色强度与染色阳性细胞百分比综合结果进行判断结果[6]。根据阳性细胞占一个400倍视野中所有细胞总数的百分比：阳性细胞数≤10%计1分；阳性细胞数>10%～50%计2分；>50%～70%计3分；>70%计4分。显色程度依据阳性强度进行判断：无染色计0分；浅染棕黄色计1分；较深棕黄色计2分；深棕黄色并且有浓染颗粒计3分。两项分数之和可定为4个级别：1分计阴性(-)；2～3分计弱阳性(+)；4～5分计中度阳性(++)；6～7分计强阳性(+++)。最终结果以3～7分计为阳性染色。评分由三名具有主任医师资格的高年资病理科医师采用盲法完成。肿瘤根据最后结果分为两组：低表达组包括阴性(-)和阳性(+)；高表达组包括中度阳性(++)和强阳性(+++)。

2 结 果

2.1miR-346、L1CAM mRNA及L1CAM蛋白在组织中的表达 结肠癌组织miR-346表达高于癌旁组织及正常结肠组织(1.272±0.501比0.621±0.168、0.201±0.078)(F=6.524,P<0.001)，癌旁组织与正常结肠组织比较差异无统计学意义(P=0.905)。结肠癌组织L1CAM mRNA表达高于癌旁组织及正常结肠组织(1.035±0.592比0.452±0.122、0.246±0.085)(F=5.183,P<0.001),癌旁组织与正常结肠组织比较差异无统计学意义(P=0.745)。L1CAM蛋白表达于结肠癌细胞膜(图1a)，在癌旁组织(图1b)及正常结肠组织(图1c)中无表达，结肠癌组织中L1CAM蛋白阳性表达率为74.6%(47/68)。结肠癌组织中miR-346与L1CAM mRNA表达呈正相关(r=0.731，P<0.001)，见图2。

2.2不同临床病理特征结肠癌患者癌组织中miR-346及L1CAM蛋白表达的比较 不同年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径、病理分型、病理类型患者结肠癌组织中miR-346及L1CAM蛋白的表达比较差异无统计学意义(P>0.05)，而在肿瘤浸润T3～T4、远处转移M1、淋巴结转移阳性、血管浸润阳性、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期及肿瘤分化程度低分化中表达更高(均P<0.05),见表1。

1a:L1CAM蛋白在结肠癌组织高表达；1b:L1CAM蛋白在正常结肠组织无表达；1c:L1CAM蛋白在癌旁组织无表达

图2 L1CAM mRNA与miR-346的相关性

3 讨 论

目前结肠癌发病率呈上升趋势,早期病情隐匿,难以诊断[7-9]。近年来，随着对Ⅳ期结肠癌治疗方案的改进及靶向药物的研发，晚期结肠癌治愈率及生存率均得到一定程度的提高，对靶向药物的探索是结肠癌生存率进一步提高的主要研究方向。随着分子生物学及基因检测的发展，为结肠癌的诊断及治疗提供了更多的肿瘤标志物、预测靶点及治疗靶点[10-12]。L1CAM是跨膜糖蛋白的一种，是免疫球蛋白超家族L1家族中的一员。L1家族成员有L1CAM(CD171)、神经束蛋白、L1CAM相近同系物等[13]。研究显示,L1CAM参与多种恶性肿瘤发生及发展，调控恶性肿瘤细胞的侵袭、转移及化疗耐药等过程，对恶性肿瘤的预后具有预测价值[14]。miRNA作为非编码RNA，通过特异性识别并结合靶mRNA 的3′-UTR参与多种肿瘤发生、发展的多个环节的调控。

表1 不同临床病理特征结肠癌患者癌组织中miR-346及L1CAM蛋白表达的比较

L1CAM：L1细胞黏附因子；a为F值，余为t值

本研究结果显示,miR-346在结肠癌组织中表达高于癌旁组织及正常结肠组织。L1CAM mRNA在结肠癌组织中的表达高于癌旁组织及正常结肠组织L1CAM蛋白表达于结肠癌细胞膜，在癌旁组织及正常结肠组织中无表达。结肠癌组织中L1CAM蛋白阳性表达率为74.6%。结肠癌组织中miR-346与L1CAM mRNA表达量呈正相关。这表明，miR-346可能通过调控L1CAM表达介导结肠癌恶性行为。另有研究显示，L1CAM在子宫内膜癌、结肠癌、食管癌及胰腺癌等恶性肿瘤中表达水平高于相应正常组织，提示肿瘤的预后不良[2-5]。本研究进一步显示，结肠癌组织中miR-346及L1CAM蛋白高表达者肿瘤浸润深度、远处转移、淋巴结转移、血管浸润、TNM分期及肿瘤分化程度均较差,肿瘤浸润深度T3及T4、远处转移、淋巴结转移、血管浸润、TNM分期差及肿瘤分化程度差的结肠癌组织中miR-346及L1CAM表达量高。这表明，在结肠癌中，miR-346及L1CAM高表达时，肿瘤侵袭及转移恶性行为能力增强，可能对肿瘤恶性行为具有促进作用。miRNA通过靶基因对结直肠癌唾液酸化的调控作用，可能在结直肠癌侵袭转移等恶性行为调控及化疗耐药方面具有重要作用。在中华地鼠卵巢细胞中，L1CAM通过磷脂酰肌醇-3-激酶及细胞外信号调节激酶通路调控糖化过程，调节细胞的增殖及转移过程[14]。Ito等[15]通过小干扰RNA敲除胃癌细胞中L1CAM表达，在胃癌细胞株中，L1CAM是通过胞外信号调节激酶通路调控胃癌细胞的增殖、侵袭及转移的恶性行为。Schirmer等[16]研究显示，在子宫内膜癌HEC1B细胞中，miR-34a过表达下调L1CAM表达，抑制细胞转移。p53激活会导致miR-34a上调，L1CAM表达下调,因此miR-34a对L1CAM具有调控作用。miR-34a可以结合到L1CAM mRNA的3′UTR端，L1CAM在转录水平受到miRNA调控[17]。通过TGGA数据挖掘、生物信息学检索及文献检索发现，miR-346在恶性肿瘤中的研究较少，miR-346通过抑制乳腺癌转移抑制因子1表达促进肝细胞癌进展[18]。有研究显示，在肝细胞癌中miR-346通过SET和MYND域包含蛋白3依赖性通路抑制细胞增殖[19]。miR-346通过靶向作用于Krüppel样因子4调节神经干细胞增殖及分化[20]。

结肠癌的发生、发展、侵袭转移及化疗耐药等的机制研究，目前以信号通路的研究及上下游调控基因的发掘为主要方向，靶向治疗及免疫治疗为肿瘤耐药提供了新的有效治疗方案，针对不同靶点的靶向药物综合治疗可能是进一步提高晚期结直肠癌生存期的策略。因此，更多治疗靶点的发现是进一步扩大靶向治疗范围的主要手段，本研究首先通过生物信息学技术预测miR-346与L1CAM可能具有相关性，L1CAM及miR-346在结肠癌中表达上调,可能对结肠癌转移及侵袭等恶性行为具有调控作用,两者可能具有靶向调控关系，成为结肠癌的肿瘤标志物或预测因子，两者可能具有上下游的调控关系，但两者的上下游关系和作用机制及是否可以成为靶向治疗的治疗靶点需进一步通过实验论证。