雌激素对缺血性脑卒中的保护作用及相关机制研究进展

任北大，程发峰，王雪茜，刘姝伶，穆 杰，纪雯婷，郝高庭，王庆国※

(1.北京中医药大学中医学院，北京 100029; 2.山西中医学院附属医院急诊科，太原 030024)

缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)是影响人类健康和生命的重要疾病之一。研究显示，我国脑卒中亚型中近70%是CIS[1]。CIS的年复发率高达17.7%[2]，具有高发病率、高致残率和高病死率的特点[3]。脑卒中发展状况不能有效缓解，将给全球，尤其是中国带来巨大社会压力和沉重经济负担[4-5]。雌激素属于甾体类固醇激素，自1923年发现以来，已证明对多种神经系统疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、脑缺血、精神分裂症等)有良好的治疗效果[6-7]。流行病学研究表明，女性绝经前CIS的发病率显著低于同年龄男性，绝经后罹患CIS的风险与男性相当，但预后较差[8-10]，可能是由于绝经后女性体内雌激素水平下降导致神经保护作用缺失，导致脑卒中发病率也随之升高[11-12]。雌激素受体(estrogen receptor, ER)主要包括经典核受体和膜受体及分别介导雌激素的基因效应和快速非基因效应，参与调节机体的生殖、记忆、学习、认知等功能[13]。以上提示，研究CIS时不应忽视雌激素及ER水平变化对疾病的影响。现以雌激素为切入点，探讨雌激素、ER对CIS的保护作用及相关机制。

1 雌激素与ER

雌激素主要由卵巢和胎盘产生，少量由肝、肾上腺皮质、睾丸产生，中枢神经系统(central nervous system，CNS)亦能合成雌激素。雌激素主要由雌二醇、雌酮及其代谢产物雌三醇组成，其中雌二醇含量最高、作用最强，雌三醇和雌酮含量较低、作用较小。雌激素作用广泛，除作用于生殖系统外，还可影响神经系统、胃肠道、肝脏、骨骼及心血管的活动[14]。

ER主要存在于靶器官细胞的细胞膜、细胞质或细胞核，可与雌激素特异性结合，形成激素-受体复合物，从而引发基因调控机制，影响下游基因的转录，进而对CIS发挥保护作用。

ER有经典核受体和膜性受体两种。经典核受体包括ERα和ERβ两种亚型，ERα主要分布在下丘脑、海马及视交叉前区，皮质分布相对较少，与神经系统和内分泌系统活动相关；ERβ主要分布在嗅球、基底前脑、大脑皮质、海马、小脑、黑质等部位，与学习记忆、运动调控相关。ERα和ERβ在海马和皮质区的分布有部分重叠，均通过基因调节效应起作用。雌二醇可直接或间接与ER，特别是ERα结合，调节基因的表达，发挥对缺血区的保护作用。膜性受体包括经典核受体的膜性成分、GPR30、Gaq-ER及ER-X等，通过快速非基因型效应起作用。Pietras和Szego[15]推测，在子宫内膜的上皮细胞和肝脏细胞上存在胞膜性ER；Pappas等[16]首次证实细胞膜上存在ERα；Filardo等[17]发现，雌激素激活细胞外信号调节激酶1/2需要GPR30的表达；Revankar等[18]发现，雌激素是GPR30的配体。Gaq-ER是一种调节氨基丁酸B受体去敏感化的ER。ER-X与ERα具有相同的C区，是一种未知的新型基因。膜受体和核受体可相互影响，共同调节神经元。

2 雌激素/ER与CIS的关系

急慢性脑缺血是导致CIS发病的核心原因，脑血流不足引起氧自由基毒性增高、兴奋性氨基酸(excitatory amino acids，EAA)毒性、炎症反应等，导致神经元凋亡、坏死，造成CIS的高致残率和高死亡率。雌激素和ER与CNS关系密切。雌激素具有脂溶性，可通过血脑屏障进入CNS。脑损伤时，局部反应性星形胶质细胞在芳香化酶的作用下可以合成雌激素，从而调节突触重建，增加脑血流量，进而促进神经再生。以上说明雌激素在一定程度上，通过一定的方式，发挥调节CNS功能的作用。这些也证实雌激素对于CIS确有疗效，提示雌激素在脑部疾病中的应用价值。

根据ER的生理特性及在脑缺血疾病中发挥的基础性调节作用，ER调节物的作用机制和对脑缺血疾病的治疗效果成为当前研究热点。

3 雌激素和ER对CIS的作用

3.1雌激素的大脑保护作用 通过对CNKI(124篇)、PubMed(183篇)，共307篇文献的整理分析发现，雌激素对CIS发挥神经保护作用主要通过拮抗EAA毒性、抗氧化应激、扩张血管、增加脑部血流量、改善神经元胞突结合的紧密型、抑制β淀粉样变性、调节细胞内Ca2+水平、增强营养机制、促进多种神经递质合成、抗凋亡、抑制动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)、抑制内皮细胞凋亡、抑制炎性因子表达、抗自由基损伤、调节内皮源性一氧化氮水平、增加葡萄糖载体蛋白的表达、促进神经生长因子表达、改善认知和记忆功能、促进细胞骨架和细胞因子恢复、保护胶质细胞、提高脑内能量代谢水平、促进新生血管生长。这些作用基本涵盖了雌激素发挥脑保护作用的全部方面。按CIS的发病特点以及雌激素所起的保护作用，可以将雌激素对CIS的作用整合为以下8个主要方面(图1)。

3.1.1EAA毒性作用 EAA是CNS的主要兴奋性神经递质，当大脑缺血时，脑内释放大量EAA，过度激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体，引起细胞膜、线粒体膜、内质网膜等部位的钙通道性状改变和Ca2+泵活性下降，Ca2+经L型电压门控通道和激动剂型门控通道内流，出现通透性转化，同时细胞器贮存的Ca2+进一步释放，最终导致细胞内Ca2+超载，而Ca2+超载是缺血性脑损害的关键环节，同时也是不同类型细胞发生凋亡的关键因素和共同触发机制。这一机制在整个神经细胞死亡过程中起着基础性的先导作用。Weaver和Legette[19]研究发现，17β-雌二醇可直接抑制NMDA受体及其诱导的动作电位，进而减弱由NMDA介导的神经毒性作用，最终明显降低细胞内Ca2+水平，从而阻断后续级联反应的发生。

3.1.2氧化应激通路 氧化应激诱导的神经细胞死亡是CIS造成神经损害的关键因素之一。脑缺血后产生的β淀粉样蛋白、谷氨酸、Fe2+可引起氧化应激反应。此外，氧自由基学说在脑缺血/再灌注所致的损伤中也发挥着较为重要的作用[20]。脑缺血/再灌注发生时，脑细胞产生过量的氧自由基，并易于与脂类、蛋白质以及核酸发生脂质过氧化反应，进而造成神经细胞、胶质细胞及血管内皮细胞损伤[21-22]。研究表明，提高内源性自由基清除剂的含量可以抑制CIS后神经细胞的凋亡[23]。在慢性脑缺血损伤中，产生的过量的一氧化氮自由基具有细胞毒性作用，而诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是一氧化氮合成的主要限速酶，被认为iNOS是一种“病理型”酶[24]。雌激素可以抑制白细胞介素(interleukin，IL)1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)α等炎性因子的释放[25]，这些炎性因子能诱导小胶质细胞、巨噬细胞表达iNOS[26]。核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是iNOS的上游因子，雌激素可通过阻止NF-κB的激活抑制iNOS的活化。另外，脑缺血发生时所产生的自由基主要是丙二醛，其含量的高低直接反映了脂质过氧化的水平，间接反映了细胞损伤的程度。同时，超氧化物歧化酶是主要的抗氧化酶之一，能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，阻断自由基一氧化氮及其产生的高毒性氧化剂，从而减轻脑组织损伤。

COX-2：环加氧酶2；IL-1β：白细胞介素1β；TNF-α：肿瘤坏死因子α；NF-κB：核因子κB；EAA：兴奋性氨基酸；NMDA：N-甲基-D-天冬氨酸；CaMKⅣ:钙调蛋白激酶2；SIK2：盐诱导激酶2；Calcineurin:钙调磷酸酶；TORC1：雷帕霉素受体复合物；CREB：环腺苷酸效应元件结合蛋白；GSK-3β：糖原合成酶激酶3β；Akt：蛋白激酶B；PI3K：磷脂酰肌醇-3-激酶；Mcl-1磷酸化：髓性白血病细胞1；NOS：一氧化氮合酶

3.1.3炎症反应通路 白细胞浸润和细胞因子的释放在CIS后炎症反应的发生和发展中发挥着关键作用。白细胞浸润是炎症反应的特征之一。IL-1β和TNF-α是触发炎症反应最为重要的两种细胞因子，两者可与效应细胞上的受体结合，促使炎症升级。IL-1β具有多重促炎、促凝及调节细胞生长的作用[27]，可被包括内皮细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞以及神经元在内的多种细胞合成[28]。Cheng等[29]发现，在CIS损害过程中雌激素的干预可以有效抑制巨噬细胞的渗出以及IL-1β和TNF-α等细胞因子的释放。

目前认为，雌激素的抗炎作用可能与抑制NF-κB的活化有关[30]。在大部分细胞中，NF-κB二聚体与细胞质中的抑制蛋白结合形成三聚体复合物，并以无活性的形式存在于胞质中。当脑缺血发生时，脑血管内皮细胞、神经元以及胶质细胞中的NF-κB被激活并快速进入核内，与核内DNA上的特异序列结合，从而促使黏附分子、细胞因子等表达，致使炎症发生。因此，NF-κB被认为是血管内皮细胞、神经元以及胶质细胞损伤的始动因素之一。雌激素抑制NF-κB活化的途径主要有两种：①雌激素具有明显的抗氧化活性，通过清除自由基，降低脑缺血时谷氨酸水平，减少NMDA受体的过度激活，阻止钙离子内流等抑制NF-κB活化[31];②NF-κB与ER相互拮抗，雌激素可通过上调受体抑制NF-κB的活化[32]。

3.1.4增加脑部血流量 雌激素主要通过以下两个方面增加缺血时脑部血流量：①雌激素与其受体相作用，促进脑血管内皮细胞增生和新血管形成,这种作用可以被ER拮抗剂ICI182780所阻断[33]；②扩张脑部血管，雌激素作为血管扩张因子能增加脑缺血区域的血流量，从而减轻脑缺血造成的损伤[34]。雌激素增加脑缺血区域血流量与以下因素有关：①通过抑制平滑肌收缩和内皮细胞释放内皮素，增加脑部血流量，减轻脑损伤。②通过阻断和激活细胞上的离子通道，从而保持细胞内外离子的平衡，进而维持平滑肌正常的舒张功能[35]。③可减轻脑微小血管结构损害，降低血管通透性，改善脑微循环。④调节胆固醇代谢和沉积，减少动脉粥样斑块形成。⑤雌激素的血管保护作用是由血管壁的ER介导的，如雌激素通过受体介导途径抑制IL-1β转换酶信使RNA的表达以及TNF-α介导的内皮细胞凋亡，从而保持内皮细胞的完整性和功能，减轻脑组织缺血损伤[36]。⑥雌激素神经保护作用与一氧化氮相关，通过增强内皮型一氧化氮合酶的活性，可以增加脑血流量[37]。

3.1.5凋亡通路 神经元的死亡包括坏死和凋亡两种方式。坏死发展迅速，不可逆，脑缺血发生时较难控制；凋亡强调自然的生理学过程，其发生受多种机制调控，因此调节凋亡过程中的关键因素可有效防止神经元凋亡[38]。Bcl-2基因是目前发现的最重要的凋亡抑制基因，是一种与线粒体膜相关联的稳定蛋白，一般位于核膜、内质网以及线粒体膜上。CIS发生后，Bcl-2在脑内表达增高，能减少海马组织神经细胞凋亡的数量。Bax蛋白是由Bcl-2的同源基因Bax编码，具有促进细胞凋亡的作用，与Bcl-2相互拮抗，并可使Bcl-2失活。因此，Bax蛋白的表达量直接影响凋亡信号刺激后细胞存活或凋亡的比率，是决定细胞凋亡严重程度的关键基因[39-40]。

Bcl-2/Bax主要通过以下4个途径抑制细胞凋亡[41]：①Bcl-2拮抗促凋亡基因Bax，减少细胞色素C自线粒体的释放，抑制细胞色素C对胱天蛋白酶(caspase)的激活；②Bcl-2促进谷胱甘肽进入细胞核，改变核内的氧化还原反应，抑制caspase的活动，减缓细胞凋亡；③通过抗氧化作用，清除氧自由基，抑制细胞凋亡；④Bcl-2/Bax蛋白的磷酸化/去磷酸化可能也与凋亡有一定关联[42]。上述机制最终发生的关键环节是caspase家族成员所介导的蛋白酶级联反应，其中caspase-3是脑缺血后神经细胞凋亡最关键的凋亡执行蛋白酶。脑缺血发生时，位于缺血梗死灶边缘的caspase-3被多种刺激信号激活，促使细胞内重要的蛋白质降解失活，从而诱导神经元凋亡[43]。

研究发现，雌激素具有调节转录的作用，能明显增加海马神经元抗凋亡基因Bcl-2的表达，说明在Bcl-2基因中存在雌激素应答元件，且在一定范围内雌激素水平与大鼠脑缺血后Bcl-2蛋白的表达呈正相关[41,44]，提示在今后的研究和临床诊治中应该考虑雌激素血药浓度的问题。此外，雌激素还能明显降低缺血梗死灶边缘caspase-3的阳性表达[45]。另外，脑皮质ER-β的增加与Bcl-2上调一致[46]，推断雌激素与脑皮质ER-β的结合使Bcl-2的表达上调，从而发挥脑保护作用。

3.1.6对As的作用 As是导致CIS的病理基础之一。雌激素通过调节低密度脂蛋白而对As的发展起抑制作用。临床实践发现，绝经后女性血清高密度脂蛋白的水平逐渐降低，而血清总胆固醇、低密度脂蛋白及三酰甘油的水平逐渐升高。此时，因雌激素水平降低，低密度脂蛋白的降解受到抑制，导致运送到动脉壁的胆固醇增多，而高密度脂蛋白的生成减少，使高密度脂蛋白清除动脉壁上沉积的胆固醇的能力降低，最终导致As。因此，可以考虑从雌激素治疗As入手预防CIS的发生。

3.1.7改善认知功能 认知功能形成的基础是突触，而突触囊泡上的蛋白质-突触素是形成突触的关键物质，突触素具有在神经元之间传递信息的作用。研究发现，雌激素缺乏则神经元营养不足，突触素活性下降，突触囊泡转运能力下降，胆碱能神经递质活性下降，神经元代谢及蛋白质合成能力下降，海马、海马旁回、颞叶以及额叶神经元活动下降，最终导致学习记忆能力下降[47]。Murphy等[48]研究发现，雌激素可明显增加诱导培养的海马细胞树突棘的数量，增加突触的连接部位，在人类和动物的学习记忆中起重要作用。研究表明，预先使用、抑或在脑缺血发生时合理使用雌激素及其受体激动剂[49]，并合理控制给药时间、剂量、途径[50]能降低CIS发生后梗死面积、改善认知记忆功能、加快卒中后的恢复[51]。

3.1.8雌激素对胶质细胞的作用 胶质细胞广泛存在于CNS中，主要包括星形胶质细胞、小胶质细胞及少突胶质细胞，通过支持和引导神经元活动，参与神经系统的修复。对于星形胶质细胞，雌激素的作用如下：①通过调节星形胶质细胞源性神经转移生长因子、胰岛素样生长因子1、胶质纤维酸性蛋白以及载脂蛋白E发挥脑保护作用；②通过改变脑损伤后星形胶质细胞的生理、生化特点发挥脑保护作用；③通过影响星形胶质细胞对神经免疫反应的调节来发挥脑保护作用；④脑损伤时星形胶质细胞可合成芳香化酶，从而促进内源性雌激素的合成[52]。

小胶质细胞对缺血的敏感性较高，当脑缺血发生时，雌激素可通过增加蛋白酶的合成，减少小胶质细胞释放氧自由基和炎性细胞因子，达到保护神经的目的[53]。小胶质细胞在CNS炎症反应和免疫应答中起关键作用。

少突胶质细胞在CNS中主要是协助神经电信号的高效传递，维持和保护神经元的正常功能。Lu等[54]研究发现，雌激素参与少突细胞中血红素加氧酶氧基1和星形胶质细胞中热激蛋白25/27的合成，并有一定的神经保护作用。

3.2ER发挥脑保护作用的机制 ER主要通过两方面发挥脑保护作用。①基因调控：主要通过调控特异性靶点基因的转录合成特殊蛋白，从而发挥脑保护作用。具体是雌激素与经典核受体结合形成激素受体复合物，进而与DNA上特殊的激素反应位点相作用，从而发挥生理功能。目前文献中提到的ER调节物有三苯氧胺、金雀异黄素等，但发挥作用的机制尚不清楚[55]。②非基因调控机制：主要是指雌激素与膜性受体结合发挥作用，具体机制尚不清楚，可能是雌激素与膜受体结合后胞内环腺苷酸增加，提高了蛋白激酶A的活性，促使Ca2+通道磷酸化，导致Ca2+内流，提高了细胞内Ca2+水平，从而发挥生物学作用。与基因调控机制相比，非基因调控机制存在4点不同：不涉及基因表达、不涉及特殊蛋白的合成、不能被信使RNA转录和蛋白质合成的抑制剂所阻断、不受经典核受体拮抗剂影响。

关于ER是否在CIS中发挥信号通路的作用，目前仍有争议。主要争议为ER是否参与了雌激素发挥神经保护作用的机制。通过总结分析近年来关于雌激素和ER的文献发现，雌激素对CIS的神经保护作用概括为[56]：①雌激素单独起作用，即使在ER拮抗剂存在的前提下，亦能有效减少缺血区及半暗带神经细胞的凋亡，证明了雌激素发挥作用存在非受体介导、非转录机制；②雌激素通过与核受体结合发挥基因调控作用；③雌激素与膜性受体结合发挥非基因调控作用。以上明确说明ER在CIS的神经保护机制中发挥着十分重要的作用，但是同样也说明了并非只是或只有ER发挥了作用，这是因为CIS的神经保护作用机制具有其特殊的复杂性，研究中应当辨证看待。

4 小 结

关于雌激素对CIS的脑保护作用、作用机制以及临床应用目前国内外研究的已较为深入，但在起作用的关键通路、药理毒理、药物间药效的影响、临床如何合理使用以及替代治疗方面，仍存在不完善之处。主要问题总结如下：①体内雌激素和雄激素可由同一组织产生，某种程度上两者亦可相互转化，因此在基础实验和临床试验中，应当对这两种激素间是否存在促进或拮抗作用予以重视。②雌激素和ER在降低脑缺血的发病率、致残率以及病死率方面的作用已被证实，但临床难以将酗酒、吸烟、情绪等受主观影响较大的因素纳入评价体系，故存在一定的片面性。③关于雌激素相关药物的使用。CIS发生后神经元的死亡涉及不同的通路，因而药物阻滞剂就存在不同的选择，这就涉及药物间协同起效和不良反应的问题。因此，针对作用机制进行有目的的药物研发具有广阔的市场前景。有研究提示，积极控制血压[57]、血脂[3]、血糖[58-59]，改善不健康的生活方式[60]、睡眠和运动，治疗睡眠呼吸暂停[61]等可预防CIS的发生。此外，避孕药、遗传性脑病同样也是CIS的危险因素[3]。使用药物时应予以考虑。④关于雌激素替代治疗CIS的相关问题。目前以植物性雌激素为代表的替代治疗较多，其优势主要在于降低长期服用雌激素产生的不良反应，而且安全、便宜[62]。植物性雌激素的主要成分富含于一些植物中药中[63-67]。但也有研究提示，老年(平均63岁)患者应用雌激素替代治疗反而加重脑卒中损伤和认知功能障碍[68]。此外，雌激素替代治疗对人的生殖发育和女性月经周期也有不良影响。⑤因涉及CIS的作用机制较为复杂，因此应当明确不同机制间相互交叉起作用的关键点，对CIS的发生有一个全面的预判和把握。⑥关于雌激素和ER治疗CIS的基础研究和临床研究在药物有效性评价方面还存在一定的差异，究其原因可能是因为两者对CIS所发生的阶段和对治疗结果的预判存在差异，应当加以考虑。