黑色素瘤中细胞凋亡抑制蛋白Survivin和MEF2D的表达及意义

王萍，陆捷洁

（海南省皮肤病医院 皮肤科，海南 海口 570206）

恶性黑色素瘤（malignant melanoma, MM）来源于黑色素细胞，具有侵袭力强、转移性高和预后极差等特点[1]。细胞凋亡异常在黑色素瘤发病过程起重要作用，Survivin是人类凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAPs）家族的成员，是目前肿瘤研究领域的热点之一[2]。肌细胞增强因子2D（myocyte enhancer factor 2D, MEF2D）在肝癌、骨肉瘤及肺癌等疾病中发挥重要抗凋亡作用[3-5]。本研究采用免疫组织化学和Western blotting检测黑色素瘤患者和皮内痣患者组织中Survivin和MEF2D的表达水平及其相关性，探讨Survivin和MEF2D在黑色素瘤发病中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收取海南省皮肤病医院皮肤科于2013年6月—2017年6月收集的21例黑色素瘤和10例皮内痣组织，均通过组织病理学确诊。标本使用4%多聚甲醛溶液固定24 h，使用石蜡包埋技术制作石蜡包块。黑色素瘤患者中男性12例，女性9例；年龄20～86岁，平均52.8岁。根据病理（Clark标准）分级：Ⅰ级5例，Ⅱ级4例，Ⅲ级6例，Ⅳ、Ⅴ级6例。皮内痣患者中男性4例，女性6例；年龄15～56岁，平均41.7岁。

1.2 主要试剂

兔抗人Survivin单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），兔抗人MEF2D单克隆抗体（美国CST公司），免疫组织化学SP染色试剂盒DAB显色剂（北京中杉金桥生物有限公司）。

1.3 免疫组织化学染色

石蜡包块连续切5张，厚4～5μm，1张进行HE染色复查诊断。采用SP法进行组织染色，实验操作按照试剂盒说明书进行：60℃烤片4 h，二甲苯脱蜡、浓度梯度乙醇水化及蒸馏水洗涤，高压修复抗原5 min，0.3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶30 min，滴加一抗（浓度参考说明书）4℃孵育过夜，PBS清洗3次，10 min/次，滴加二抗常温孵育1 h，DAB显色，苏木精复染后使用盐酸分化和氨水返蓝，乙醇浓度梯度脱水，二甲苯透明和中性树胶封片，使用显微镜观察拍片。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 判定标准

随机选取高倍镜下4个视野，按染色强度进行打分，染色强度与背景着色相对比：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。统计300个肿瘤细胞中Survivin或MEF2D阳性表达细胞数，依据阳性细胞所占比例判断Survivin或MEF2D表达水平：0分为阴性，1分为≤10%，2分为＞10%～50%，3分为＞50%～75%，4分为＞75%。染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥2分为免疫染色阳性。

1.5 Western blotting检测

黑色素瘤和皮内痣组织切成小块置入研磨器，加入400μl蛋白裂解液后研磨，转移研磨液至1.5 ml离心管，使用震荡器震荡30 s，置于冰上10 min，4℃、15 000 r/min离心15 min。留取5μl蛋白上清液定量，其余加入6×Loading buffer（体积比1∶5），沸水煮沸5 min变性。取30μg蛋白上样，SDS-PAGE胶进行电泳分离，110 V电压转膜2 h。5%脱脂奶粉封闭1 h，将膜置于特定一抗，4℃摇床上孵育过夜。使用TBST洗膜3次，10 min/次，置于相应的二抗常温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，后用ECL显影液进行显影，目的蛋白表达量通过与内参蛋白β-actin标准化后得到相对比值。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计学软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，计数资料以率（%）表示，比较用Fisher确切概率法，相关性分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Survivin、MEF2D蛋白阳性率比较

免疫组织化学结果显示，Survivin蛋白染色阳性呈棕黄色颗粒，主要定位于细胞浆，少数细胞核中亦可见染色。黑色素瘤组织中有15例阳性表达，阳性率为71.4%（15/21），皮内痣中有0例阳性表达，阳性率为0.0%（0/10），经Fisher确切概率法，差异有统计学意义（P=0.000）。见图1A、B。

MEF2D蛋白阳性棕黄色颗粒主要定位于细胞核，少数胞浆中亦可见表达。黑色素瘤组织中阳性率为76.2%（16/21），皮内痣组织中阳性率为20.0%（2/10）。经Fisher确切概率法，差异有统计学意义（P=0.006）。见图1C、D。

2.2 Survivin、MEF2D蛋白表达与临床特征的关系

Survivin和MEF2D蛋白在黑色素瘤组织中呈高表达，分析其与临床病理特征的关系发现，随着病理分级增加，Survivin和MEF2D蛋白阳性率逐渐升高（P＜0.05）。Ⅰ、Ⅱ级肿瘤组织免疫组织化学结果显示，Survivin阳性率为33.3%（3/9），Ⅲ、Ⅴ级阳性率为83.3%（10/12），经Fisher确切概率法，差异有统计学意义（P＜0.05）。MEF2D阳性表达率在Ⅰ、Ⅱ级肿瘤组织中为44.4%（4/9），Ⅲ、Ⅴ级肿瘤组织中为91.7%（11/12），经Fisher确切概率法，差异有统计学意义（P＜0.05）。Survivin和MEF2D蛋白表达与年龄、性别无关（P＞0.05）。见附表。

图1 Survivin和MEF2D蛋白在皮内痣组织和黑色素瘤组织中的表达 （免疫组织化学×400）

2.3 黑色素瘤组织中Survivin和MEF2D蛋白的表达

Western blotting检测结果显示，皮内痣组织未检测到Survivin蛋白表达或表达极弱，而黑色素瘤组织中Survivin不同程度表达；皮内痣组织MEF2D蛋白表达极弱，而黑色素瘤组织中MEF2D蛋白呈不同程度高表达。

使用Image-J软件分析Survivin和MEF2D蛋白相对内参表达量灰度值。图2中1的Survivin相对表达量为（0.155±0.009），2为（1.117±0.016），两者比较，差异有统计学意义（t=90.770，P=0.000）；3的Survivin相对表达量为（0.277±0.032），4为（1.955±0.045），两者比较，差异有统计学意义（t=52.630，P=0.000）；5 的 Survivin 相对表达量为（0.741±0.042），6为（1.528±0.096），两者比较，差异有统计学意义（t=13.470，P=0.000）。1的 MEF2D相对表达量为（0.707±0.064），2为（1.612±0.083），两者比较，差异有统计学意义（t=14.960，P=0.000）；3的 MEF2D相对表达量为（0.728±0.047），4为（1.740±0.076），两者比较，差异有统计学意义（t=19.620，P=0.000）；5的 MEF2D相对表达量为（0.869±0.053），6为（2.015±0.077），两者比较，差异有统计学意义（t=21.230，P=0.000）。见图 2、3。

图2 Survivin、MEF2D蛋白在黑色素瘤和皮内痣组织的表达

图3 Survivin、MEF2D蛋白在黑色素瘤和皮内痣组织中的表达水平比较 （±s）

2.4 黑色素瘤患者Survivin与MEF2D蛋白表达的相关性

21例黑色素瘤患者中Survivin和MEF2D表达均阳性者12例，均阴性者4例；Survivin表达阳性，MEF2D表达阴性者3例；Survivin表达阴性，MEF2D表达阳性者2例。Survivin与MEF2D蛋白表达水平呈正相关（r=0.447，P=0.042）。

3 讨论

近年来，中国每年新增黑色素瘤患者2万余例，发病率呈逐年上升趋势[6]。晚期黑色素瘤患者由于手术疗效不佳，且对放化疗不敏感，导致其5年生存率偏低。既往研究发现，放化疗主要是通过诱导黑色素瘤细胞凋亡起到杀伤作用，治疗不敏感的原因是肿瘤细胞产生凋亡抵抗，因此发现黑色素瘤细胞凋亡相关基因对其靶向治疗可能会起到关键作用。

Survivin是凋亡抑制蛋白IAPs家族中抗凋亡能力最强的蛋白之一，目前广泛高表达于各种肿瘤，如肺癌、口腔癌和肝癌等[7-9]。Survivin在肿瘤中呈高表达且可以抑制肿瘤细胞的凋亡，从而促进肿瘤的发生、增殖及对化疗的耐药性。Survivin被认为是多种肿瘤的新型标志物，用来协助肿瘤早期诊断、评估患者进展及预后。CARPI等[10]发现，通过寡脱氧核苷酸分子信标靶向Survivin mRNA达到抗肿瘤作用。本研究发现，Survivin在黑色素瘤组织中阳性率为71.4%，而在皮内痣组织中未见表达。同时，在Ⅰ、Ⅱ期黑色素瘤中Survivin阳性表达率为33.3%，而在Ⅲ、Ⅳ期黑色素瘤中阳性表达率为83.3%，提示随着病理分期增加Survivin阳性率有所升高。此外，通过Western blotting检测发现黑色素瘤组织中Survivin蛋白表达高于皮内痣组织。

MEF2是转录因子MADS-box调节家族中的一员，MEF2家族包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D[11]。既往研究发现，MEF2D能增加肝细胞癌增殖能力，在肝癌的发生、发展中具有重要意义[12]。此外，MEF2D在肺癌和神经元细胞中发挥抗凋亡作用[5]。MEF2D除了在实体肿瘤中发挥抗凋亡作用，与白血病的发生也存在明显联系[13]。本研究发现，MEF2D在黑色素瘤组织中阳性率为76.2%，而在皮内痣组织中阳性率为20.0%。同时，在Ⅰ、Ⅱ期黑色素瘤中MEF2D阳性率为44.4%，而在Ⅲ、Ⅳ期黑色素瘤中阳性率为91.7%，提示随着病理分级增加MEF2D阳性表达率升高。Western blotting检测发现黑色素瘤组织中MEF2D蛋白表达高于皮内痣组织。本研究中发现，MEF2D与Survivin蛋白表达呈正相关，提示MEF2D与Survivin可能存在调控关系，但具体调节过程及机制仍需进一步探究。

近年来，分子靶向治疗在很多肿瘤中取得突破性进展。本研究证实，黑色素瘤组织中MEF2D、Survivin异常高表达，且与病理分级存在密切联系，以两者作为靶点对黑色素瘤进行综合治疗将会取得更好的疗效，为黑色素瘤治疗提供新思路。