LncRNA-ATB在非小细胞肺癌细胞中的作用及其机制探讨*

李柏森，姜鹤群，文敏，易红梅，李涛

[1.西南医科大学附属医院 肿瘤科，四川 泸州 646099；2.成都医学院第一附属医院 肿瘤科，四川 成都 610500；3.电子科技大学医学院附属肿瘤医院(四川省癌症防治中心)，四川成都 610041；4.成都医学院第一附属医院 胸心外科，四川 成都 610500]

约80%肺癌为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）[1]，其预后差，总体生存率＜20%[2]。远处转移是NSCLC死亡的主要原因[3]。因此，深入阐明其发生、发展中的分子机制有巨大的现实意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA activated by transforming growth factor β, LncRNA-ATB）是一类转录本＞200 nt的几乎不具有蛋白编码能力的RNA[4]。近年来，许多LncRNA被证实在NSCLC侵袭和转移过程中发挥重要作用[5-6]。然而，LncRNA-ATB在NSCLC中的表达及功能尚未充分阐明。本研究拟探索LncRNA-ATB在NSCLC中的表达及其功能。

1 材料与方法

1.1 材料

NSCLC和正常支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells, HBEC）选取2012年3月7日—2015年5月8日在四川省肿瘤医院就诊的患者。NSCLC分为A549和HCI-H23细胞。用Trizol（美国Sigma公司）提取RNA，RNA逆转录和实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司，qRT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，Transwell小室（美国Millipore公司），基质胶（美国BD公司），萤光素酶报告基因检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及逆转录 将细胞铺6孔板培养过夜至汇合度为80%，每孔加入1 ml Trizol裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心5 min，上清转移至一新离心管中。加入裂解液1/5体积的氯仿，用力振荡至充分乳化。4℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清液至一新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒15次，静置10 min。4℃、12 000 r/min离心15 min，弃上清，加入75%乙醇1 ml，14℃、12 000 r/min离心5 min。所得沉淀加入20μl去离子水，即为所需RNA。

1.2.2 逆转录 将 1μl RNA，2μl 5× PrimeScript RT Master，7μl去离子水轻柔混匀后，进行逆转录反应。反应条件为：37℃15 min，85℃5 s，4℃储存。

1.2.3 qRT-PCR 总反应体系25μl，具体如下：SYBR premix Ex TaqⅡ 12.5μl，正义链反义链引物各1μl，实时定量产物2μl，去离子水8.5μl。PCR反应条件为： 95℃预变性30 s，95℃变性15 s，60℃退火30 s，共30个循环。反应结束后样品保存于4℃。采用 2-ΔΔCt法计算，LncRNA-ATB/microRNA-141（miR-141）相对表达量=2-（CTLncRNA-ATB/miR-141-CTU6）待测样本-（CTLncRNA-ATB/miR-141-CTU6）校准样本。

1.2.4 Transwell实验 在 Transwell下室中加入600μl含10%胎牛血清的1640培养基（细胞侵袭实验采用预先铺好基质胶的Milipore小室，细胞转移实验采用Milipore小室），上室中加入200μl约2×105个细胞，置于细胞培养箱中培养48 h。弃上室液体，小心取出小室，湿棉签去除未穿过膜的细胞。甲醇固定2 min，结晶紫染色5 min，PBS洗涤，切下小室膜，封片。显微镜200倍视野下统计随机10个视野的细胞数，拍照并绘制统计图。

1.2.5 细胞划痕实验 将NSCLC细胞铺板，孵育过夜至细胞融合率达100%。用1 ml枪头均匀地在细胞培养孔中划痕，划痕后用PBS洗涤细胞3次，加入不含血清的培养基，拍照，此时细胞间距离为0 h距离。置于细胞培养箱中继续培养24 h，再次拍照，此时细胞间距离为24 h距离。细胞迁移距离为2次细胞间距离之差再除以2。

1.2.6 荧光素酶报告基因实验 细胞培养过夜至汇合度达70%后，共转染miR-141 mimics/miR-141 NC和pmiR-GLO-WT质粒。裂解细胞后，取10μl样品加入100μl荧光素酶检测试剂，上机测定荧光值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，方差分析后的两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA-ATB在NSCLC和HBEC细胞中的表达

qRT-PCR结果显示，LncRNA-ATB在HBEC细胞中的相对表达量为（1.000±0.050），在NSCLC的A549细胞中相对表达量为（4.319±0.158），在NSCLC的NCI-H23细胞中相对表达量为（4.753±0.031）。经方差分析，差异有统计学意义（F=25.417，P=0.011）。进一步两两比较经LSD-t检验，NSCLC的A549和NCI-H23细胞中LncRNA-ATB表达水平高于HBEC细胞（t=5.435和6.416，P=0.016和0.014）。见图1。

图1 NSCLC和HBEC细胞中LncRNA-ATB的表达水平比较 （±s）

本研究合成特异性沉默LncRNA-ATB表达的shRNA，qRT-PCR结果显示，转染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23细胞中LncRNA-ATB的相对表达量均为（1.000±0.050）；转染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23细胞中LncRNA-ATB的相对表达量分别为（0.228±0.027）和（0.332±0.019），经t检验，两组间LncRNA-ATB表达差异有统计学意义（A549：t=5.731，P=0.021；NCI-H23：t=4.135，P=0.029）。LncRNA-ATB shRNA 可有效地沉默NSCLC细胞中LncRNA-ATB的表达（见图2）。

2.2 LncRNA-ATB与NSCLC细胞转移能力的关系

转染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23细胞的相对转移细胞率为（100.0±5.0）%；转染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23细胞的相对转移细胞率为（25.3±3.2）%和（30.9±3.8）%，经t检验，差异有统计学意义（A549：t=4.332，P=0.033；NCI-H23：t=3.451，P=0.037），沉默 Lnc-ATB可抑制NSCLC细胞的转移能力。见图3、4。

图2 转染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23细胞中LncRNA-ATB的表达水平比较 （±s）

图3 LncRNA-ATB促进NSCLC细胞转移 （×200）

图4 转染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23细胞的相对转移细胞率比较 （±s）

2.3 LncRNA-ATB与NSCLC细胞侵袭能力的关系

转染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23细胞的相对侵袭细胞率为（100.0±5.0）%；转染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23细胞的相对侵袭细胞率为（20.8±2.2）%和（24.9±1.7）%，经t检验，差异有统计学意义（A549：t=5.482，P=0.017；NCI-H23：t=4.513，P=0.021），沉默 Lnc-ATB可抑制NSCLC细胞的侵袭能力。见图5、6。

图5 LncRNA-ATB促进NSCLC细胞侵袭 （×200）

图6 转染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23细胞的相对侵袭细胞率比较 （±s）

2.4 LncRNA-ATB与NSCLC细胞转移距离的关系

转染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23细胞的相对转移距离均为（1.000±0.050）μm；转染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23细胞的相对转移距离为（0.423±0.024）和（0.381±0.029）μm，经t检验，差异有统计学意义（A549：t=2.317，P=0.042，NCI-H23：t=2.726，P=0.039），沉默 Lnc-ATB可缩短NSCLC细胞的转移距离。见图7、8。

2.5 LncRNA-ATB在NSCLC细胞中吸附miR-141

生物信息学预测结果显示，LncRNA-ATB存在miR-141结合位点。荧光素酶报告基因结果显示，转染miR-141 NC和miR-141 mimics的pmirGLOLncRNA-ATB相对荧光强度分别为（1.000±0.050）和（0.346±0.029），经t检验，差异有统计学意义（t=2.817，P=0.037），miR-141 mimics可特异性地与pmirGLO-LncRNA-ATB结合，并降低其荧光强度。见图9。

图7 LncRNA-ATB延长NSCLC细胞转移距离 （×100）

图8 转染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23细胞的相对转移距离比较 （±s）

图9 两组相对荧光强度比较 （±s）

2.6 LncRNA-ATB在NSCLC细胞中下调miR-141的表达

转染miR-141 NC的A549和NCI-H23细胞中LncRNA-ATB的相对表达量均为（1.000±0.050）；转染miR-141 mimics的A549和NCI-H23细胞中LncRNA-ATB的相对表达量分别为（1.032±0.019）和（0.983±0.029），经t检验，差异无统计学意义（A549：t=0.618，P=0.295；NCI-H23：t=0.561，P=0.332），转染miR-141 mimics不能降低NSCLC细胞中LncRNA-ATB的表达水平（见图10）。转染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23细胞中miR-141的相对表达水平均为（1.000±0.050）；转染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23细胞中miR-141的相对表达水平为（3.517±0.132）和（2.771±0.216），经t检验，差异有统计学意义（A549：t=5.321，P=0.009；NCI-H23：t=4.316，P=0.015），沉默NSCLC细胞中LnRNA-ATB的表达可促进miR-141的表达（见图11）。

图10 转染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23细胞中LncRNA-ATB的表达水平比较 （±s）

图11 转染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23细胞中miR-141的表达水平比较 （±s）

3 讨论

LncRNA在多种肿瘤中异常表达，并与肿瘤细胞的发生、发展密切相关，是近年来研究的热点之一。LncRNA-ATB位于14号染色体（ENST00000493038），在肝细胞癌中表达上调，与肝细胞癌患者不良预后密切相关[7]。更为重要的是，多项研究表明lncRNAATB在胃癌[8]、结肠癌[9]、乳腺癌[10]及甲状腺乳头状癌[11]等多种肿瘤中异常高表达，并与肿瘤侵袭、转移密切相关。最新研究显示，LncRNA-ATB在NSCLC组织中的表达异常升高，并与NSCLC患者不良预后密切相关[12]。本研究结果显示，LncRNA-ATB在NSCLC细胞中的表达水平高于HBEC细胞。沉默NSCLC细胞中lncRNA-ATB的表达后，NSCLC的侵袭和转移能力受抑制，提示lncRNA-ATB可能在NSCLC细胞中扮演抑癌基因的角色。

值得注意的是，一些IncRNAs可以作为竞争性内源性RNA（competing endogenous RNAs, ceRNA），通过与miRNA特异性地结合而调控其靶基因。研究显示，LncRNA-HOTAIR可通过与miR-331-3p结合而调控HER2的表达，从而促进乳腺癌的进展[13]。LncRNAARSR可作为miR-34和miR-449的ceRNA，促进AXL和c-MET的表达，从而促进肾细胞癌细胞对舒尼替尼耐药[14]。在肝细胞癌中，LncRNA-ATB可作为miR-200家族的ceRNA，调控ZEB1和ZEB2的表达[7]。本研究结果显示，LncRNA-ATB可与miR-141特异性结合并调控其表达，提示LncRNA-ATB在NSCLC细胞中可能作为miR-141的ceRNA，调控NSCLC细胞的侵袭和转移。

miR-141属于miR-200家族。研究显示，miR-200家族与肿瘤干细胞形成、上皮间质转化关系密切[15]。在miR-200家族中，miR-200bc/429和miR-200a/141簇在序列上有高度同源性[16]。多项研究显示，miR-200/141可抑制头颈部鳞状细胞癌、NSCLC、女性生殖系统肿瘤和肾细胞癌等多种肿瘤细胞的侵袭、转移、增殖及耐药[17-19]。更为重要的是研究显示，在胃癌中LncRNA-ATB可与miR-141特异性结合，并降低其表达水平[20]。本研究结果显示，LncRNA-ATB在NSCLC细胞中可特异性结合miR-141，并降低其表达水平，与既往研究结果一致。此外，本研究结果显示，LncRNA-ATB可促进NSCLC细胞的侵袭和转移。结合既往文献，笔者推测LncRNA-ATB可能通过竞争性地与miR-141结合并促进其降解，而解除miR-141对下游靶基因的抑制，从而促进NSCLC细胞的侵袭和转移。值得注意的是LncRNA-ATB在乳腺癌[10]、肾癌[14]、肝癌[7]等多种肿瘤细胞中高表达，并可通过上调ZEB1、c-MET等，促进肿瘤细胞的侵袭和转移，因此LncRNA-ATB吸附miR-141仅为其促进NSCLC细胞侵袭和转移的机制之一，更为复杂的作用机制仍需进一步研究证实。

综上所述，本研究通过qRT-PCR检测NSCLC和HBEC细胞中LncRNA-ATB的表达差异，发现LncRNA-ATB在NSCLC细胞中的表达水平高于HBEC细胞。沉默NSCLC细胞中LncRNA-ATB的表达后，NSCLC细胞的侵袭和转移能力降低。研究结果显示，LncRNA-ATB在NSCLC细胞中可吸附并下调miR-141的表达。本研究进一步明确NSCLC细胞侵袭和转移的分子机制，有助于发现新的NSCLC靶向治疗靶点。