铁皮石斛不同花期及花朵不同部位活性组分分析

辛小雪，王雪香，李明宇，郭红艳，王晓洁，苏 钛，徐 萍，程 瑾

（1.北京林业大学 生物科学与技术学院 花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室，北京 100083；2.国家林业和草原局 野生动植物保护与自然保护区管理司，北京100714；3.云南省药物研究所，云南昆明 650111；4.北京延庆区果品服务中心，北京 102100）

石斛属Dendrobium为兰科Orchidaceae多年生草本附生植物，全世界有1 500～2 000种，广泛分布于亚洲热带、亚热带地区以及大洋洲［1-2］。在中国，石斛属植物主要分布于华南、西南和华东地区，常用的药用栽培石斛有30余种［3-4］。其中铁皮石斛Dendrobium officinale作为药用价值较高的一种，因具有益胃生津、滋阴清热的功效，其新鲜或干燥茎被单列收载于2015版《中华人民共和国药典》中，以区别于其他药用石斛［5］。现代研究表明，铁皮石斛在提高免疫力，抗肿瘤，降血糖血压，抗疲劳，促消化，抗肝损伤等方面有显著功效［6-8］。近年来，铁皮石斛的人工繁育和培植技术取得了一系列的进展［9-10］，并在云南、浙江、安徽、福建、广西、贵州等地开展了规范化人工大棚栽培和生态化的仿野生种植，其栽培品已成为与野生铁皮石斛药用成分指标相近的绝佳替代品。铁皮石斛常以茎入药，其主要功能成分为多糖、黄酮类、酚类、联苄类、菲类、氨基酸、矿质元素等［11-14］。其中多糖是铁皮石斛重要的功能活性物质，酚类和黄酮类化合物含量也被认为与自由基清除能力有显著相关性，具有抗氧化，抗肿瘤的药理活性［15-17］。随着铁皮石斛多样性产品的开发，铁皮石斛花因具有与茎相似的多糖、黄酮类、有机酸类和萜类等资源性成分和功效而逐渐被关注［18-20］。但相关研究多限于花中单一活性成分的提取或水提物的功能鉴定，对花中主要化学成分的积累及分布研究相对较少，使铁皮石斛花产品停留在初加工水平，造成了资源浪费。本研究通过对铁皮石斛花苞期、微开期及盛花期3个不同花期及盛花期花被、合蕊柱和子房3个不同花部位的多糖、总黄酮、总酚质量分数的研究，旨在探讨铁皮石斛花的活性成分组成，确定铁皮石斛花的最佳采收期及最佳采收部位，进一步优化铁皮石斛花产品的精加工工艺。

1 材料与方法

1.1 植物材料

铁皮石斛花样品采自广西乐业县雅长兰科植物国家级自然保护区铁皮石斛种植基地，分别采集处于花苞期、微开期、盛花期的铁皮石斛花鲜品，以及盛花期铁皮石斛花花被、合蕊柱和子房3个部位的鲜品。所有鲜品均于80℃干燥箱中干燥4 h后得干燥样品，铁皮石斛不同花期及盛花期不同花部位的干燥样品经粉碎后过60目筛，得各处理待测样品。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 实验试剂 D-无水葡萄糖（上海源叶生物科技有限公司）；芦丁（北京索莱宝科技有限公司）；没食子酸、硝酸铝（国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇、亚硝酸钠、碳酸钠、浓硫酸（北京化工厂）；氢氧化钠（西陇科学股份有限公司）；苯酚［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］。其中D-无水葡萄糖、芦丁为色谱纯，其余为分析纯。

1.2.2 实验仪器 电子分析天平ML 104（梅特勒-托利多仪器有限公司）；恒温水浴锅DZKW-D-2（北京市永光明医疗仪器有限公司）；紫外可见分光光度计Bio Mate 3S［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；真空泵GM-0.33A（天津市津腾实验设备有限公司）；旋转蒸发仪IKA RV10（艾卡仪器设备有限公司）；恒温循环器HX-1050［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；超声波清洗器KQ 5200E（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 实验方法

采用2015版《中华人民共和国药典》［5］中水溶醇沉法提取花中多糖成分，苯酚-硫酸法测定多糖质量分数。参照唐静月等［21］总黄酮测定方法，以体积分数为80%乙醇超声波法提取花中总黄酮成分，亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定总黄酮质量分数。参考GB/T 31740.2-2015《茶制品第2部分：茶多酚》，以体积分数为80%乙醇超声波法提取花中总酚成分，采用福林酚法测定其总酚质量分数。

1.4 数据处理

铁皮石斛花不同花期及盛花期不同部位的多糖、总黄酮、总酚的质量分数用均值±标准差表示，并运用SPSS 17.0进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛花不同花期及盛花期不同部位花形态特征

铁皮石斛花苞期花为绿色，花瓣完全包裹在内（图1A）；微开期花瓣微张，向内倾斜（图1B）；盛花期花完全张开，花为黄色，花各部位清晰可见（图1C）。铁皮石斛盛花期各部位解剖如图1D所示，其雌蕊和雄蕊合生特化成合蕊柱，为兰科植物所特有的结构；花萼、花瓣及唇瓣统称为花被。

图1 铁皮石斛鲜花不同花期及盛花期花解剖结构Figure 1 Dendrobium officinale flower at different flowering stages and anatomic structures at flourishing flowering stage

2.2 铁皮石斛花不同花期及盛花期不同部位多糖质量分数变化

如表1和表2所示：从花苞期到微开期再到完全开放的盛花期过程中，铁皮石斛花中多糖成分逐渐积累，其中盛花期多糖质量分数为61.5 mg·g－1，显著高于花苞期和微开期；微开期为55.3 mg·g－1，花苞期为45.6 mg·g－1，二者无显著差异。盛花期花不同部位多糖质量分数的测定结果显示：花被中多糖质量分数最高，为64.5 mg·g－1，合蕊柱次之为61.2 mg·g－1，二者无显著差异。子房与花被、合蕊柱的多糖质量分数具有显著差异（P＜0.05），仅为52.3 mg·g－1。结果表明铁皮石斛花不同花期多糖质量分数为盛花期＞微开期＞花苞期；盛花期花不同部位多糖质量分数为花被＞合蕊柱＞子房。

2.3 铁皮石斛花不同花期及盛花期不同部位总黄酮质量分数变化

如表1和表2所示：铁皮石斛不同花期总黄酮质量分数在花苞期最高，为19.9 mg·g－1，盛花期为19.2 mg·g－1， 二者无显著差异； 微开期最低， 为 17.4 mg·g－1， 与花苞期和盛花期存在显著差异（P＜0.05）。 盛花期铁皮石斛花被中总黄酮质量分数最高（24.2 mg·g－1）， 其次是合蕊柱， 为 14.3 mg·g－1， 子房最低，为11.4 mg·g－1。因此铁皮石斛花不同花期总黄酮质量分数为花苞期＞盛花期＞微开期。盛花期花不同部位总黄酮质量分数为花被＞合蕊柱＞子房，三者差异显著。

2.4 铁皮石斛花不同花期及盛花期不同部位总酚质量分数变化

铁皮石斛花中酚类物质质量分数随花的逐渐开放而积累，盛花期花中总酚质量分数达到最大值为22.2 mg·g－1，显著高于微开期和花苞期；微开期为 19.6 mg·g－1， 花苞期最低， 为 18.5 mg·g－1（表 1）。盛花期铁皮石斛花不同部位总酚质量分数存在显著差异（P＜0.05），其中花被最高，为26.5 mg·g－1，合蕊柱次之，子房最低，总酚质量分数分别是19.2和13.9 mg·g－1（表2）。结果表明铁皮石斛花不同花期总酚质量分数为盛花期＞微开期＞花苞期；盛花期花不同部位总酚质量分数为花被＞合蕊柱＞子房。

表1 不同花期铁皮石斛全花多糖、总黄酮及总酚质量分数Table 1 Contents of polysaccharides,total flavonoids and total phenols in entire flower of Dendrobium officinale at different flowering stages

表2 盛花期铁皮石斛花不同部位多糖、总黄酮及总酚质量分数Table 2 Contents of polysaccharides,total flavonoids and total phenols in different parts of D.officinale flower at flourishing flowering stage

3 讨论

铁皮石斛花中多糖随花的开放而逐渐积累，表现在盛花期花多糖质量分数显著高于微开期，高于花苞期，这种规律性与黄秀红等［22］的研究结果相同。铁皮石斛花不同部位均含有一定的多糖成分，其中花被中多糖质量分数最高。铁皮石斛花中多糖质量分数虽与茎中差异较大［19,23］，但花中多糖的单糖组成与茎相似，且花中多糖有非常强的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力［20,24］。

铁皮石斛茎、叶、花中均含有大量黄酮类化合物，并具有清除自由基、抗氧化和降血糖等药理活性，其中花中黄酮类化合物质量分数及抗氧化能力显著高于茎［18,23,25-27］。本研究结果发现铁皮石斛花苞期及盛花期花中总黄酮质量分数较高，并高于黄秀红等［22］的测定结果，但低于龚庆芳等［23］的测定结果，这可能与品种及提取方法不同有关。铁皮石斛各花期总黄酮质量分数均显著高于其他石斛花中总黄酮质量分数，如球花石斛Dendrobium thyrsiflorum，鼓槌石斛D.chrysotoxum［22,28］。因此若以黄酮类物质作为药用产品开发，可优先选择铁皮石斛花作为提取材料，以花苞期或盛花期作为最佳采收期。

酚类是植物中的天然抗氧化剂，也是铁皮石斛的药用活性成分之一，具有较强的清除自由基和抗衰老的功效［23,29-30］。铁皮石斛花中总酚质量分数随花的开放而逐渐积累，盛花期最高，花被是酚类物质的主要积累部位。有研究发现：铁皮石斛花中总酚质量分数与茎中相近，抗氧化作用也无较大差异［23］，因此若以总酚作为铁皮石斛的目标产物，花材料可作为茎的补充材料加以利用，盛花期为花的最佳采收期，花被为精加工产品的最佳采收部位。此外铁皮石斛花中总酚与总黄酮质量分数较高且相近，使得铁皮石斛花具有很强的抗氧化活性，这可能也是铁皮石斛花具有 “滋阴”功效的原因之一［31］，但花中酚类与黄酮类物质的具体活性成分还有待进一步研究。

雅长铁皮石斛2014年成为国家地理标志保护产品，这是广西乐业县迄今为止唯一获得国家地理标志产品保护的产品。从节约生产成本及药用效益最大化的方面考虑，建议选择盛花期作为铁皮石斛花的最佳采收期；盛花期花被作为最佳采收部位。多糖，黄酮类及酚类化合物是铁皮石斛花中的主要活性组分，其中花中总黄酮及总酚质量分数较高，可作为药用组分进一步开发研究。铁皮石斛花中活性组分含量受品种、生长地和生长周期的影响，铁皮石斛栽培品种多，栽植范围广，有关铁皮石斛种源和栽培方法与其活性组分积累的关系值得开展深入研究。