肾上腺髓质素对实验性溃疡性结肠炎小鼠作用的研究

栗 静，霍丽娟

山西医科大学第一医院消化内科，山西 太原 030000

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是结肠黏膜的慢性非特异性炎性疾病，属炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的主要类型。UC的病因及发病机制尚不十分明确，其发生被认为与感染、免疫、遗传和环境等诸多因素相关，越来越多的研究表明，免疫异常在UC发生和发展的过程中发挥重要的作用[1-2]。

UC患者存在肠道菌群失调，在各种微生物抗原刺激下，激活体内免疫系统，导致细胞因子的失衡，各种炎症细胞活化，产生肠道的慢性炎症反应。此过程可由Toll样受体4(TLR4)介导。Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)是一种细胞跨膜蛋白，通过对病原微生物的识别触发信号传导通路从而激活免疫系统。其中，TLR4被认为是促进UC发病的重要免疫因素[3]。TLR4在人类正常结肠黏膜上皮细胞中呈低表达，而在UC患者的结肠黏膜中呈高表达，可以特异性识别格兰阴性菌的细胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)[4-5]，从而介导肠上皮细胞对LPS的高反应性，参与肠道黏膜屏障和共生内环境的稳定。UC患者结肠黏膜上皮屏障发生损伤，使肠黏膜上皮直接暴露于大量肠道菌群，TLR4的表达上调，明显增加了黏膜上皮细胞对LPS的敏感性，LPS通过诱导TLR4二聚体化启动胞内信号转导，并通过下游的信号传导分子髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)进行胞内信号传导，导致核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)激活，促进下游炎症因子如TNF-α、IL-6等的表达，从而破坏肠道免疫稳态，进而扩大炎症反应，最终导致UC发生[6]。

肾上腺髓质素(adrenomedullin，AM)是一种血管活性肽，广泛分布于正常肾上腺髓质、心脏、肺、肾、胃肠道、血浆和尿液中[7]。以往研究表明，AM有抑炎、抗菌、保护肠黏膜屏障并降低肠黏膜通透性等作用。在临床应用方面，能够使难治性UC患者临床症状缓解、镜下炎症浸润减轻，且无明显的不良反应发生，从而推测AM可能成为一种有效治疗UC的药物[8-9]。AM已被证实可以通过抑制NF-κB活化，下调NF-κB p65的表达，从而调节免疫与炎症反应，对UC动物模型起保护作用，但是否与TLR4介导的MyD88/NF-κB信号通路有关尚缺乏相关报道[10-11]。本实验中我们采用DSS诱导小鼠UC模型，通过外源性给予AM，观察AM对UC小鼠的作用，并探讨其可能的作用机制，为临床UC的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及主要试剂清洁级♂C57BL/6小鼠30只，鼠龄6～8周，购自中国军事医学科学院试验动物中心，标准饮食，自由饮水。AM购自吉尔生化公司，TLR4抗体(货号：13556)、MyD88抗体(货号：2068)、NF-κB抗体(货号：16502)和β-Actin(货号：8227)购自基因美科技有限公司，NF-κB ELISA试剂盒(货号：JYM0102Mo)、TNF-α ELISA试剂盒(货号：JYM0218Mo)及IL-6 ELISA试剂盒(货号：JYM0012Mo)购自基因美科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 动物分组及UC模型建立：30只清洁级♂C57BL/6小鼠随机分为3组：正常对照组、模型组、AM干预组，每组10只，体质量差异无统计学意义(P>0.05)。适应性喂养1周后，采用COOPER等[12]的经典方法造模，模型组和AM干预组给予质量浓度为40 g/L的DSS水溶液自由饮用7 d，建立小鼠急性UC模型，正常对照组小鼠给予自来水自由饮用。

1.2.2 药物干预及标本处理：造模期间观察各组小鼠精神状态、皮毛光泽度、饮食情况、大便性状、记录小鼠体质量改变，对小鼠进行疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分，DAI=(体质量分数+大便性状评分+大便潜血评分)/3。评估模型建立成功后，各组小鼠恢复正常饮水，对照组和模型组给予生理盐水每天0.5 ml/只灌肠，AM组每天给予0.5 μg/(ml·只)灌肠，连续灌肠7 d后，眼球取血，室温静置1 h后3 000 r/min离心10 min(离心半径为12.5 cm)，取上层血清，冻存于-20 ℃待检。解剖小鼠，分离结肠，量取结肠长度后记录。摘除结肠外壁脂肪组织及肠系膜等杂质，沿肠系膜缘纵轴剖开结肠后用冰生理盐水清洗肠壁及内容物，低温下肉眼观察结肠大体损伤情况，采用大体形态损伤指数(colon macroscopic damage index，CMDI)[13]评分，评估其结肠黏膜损伤程度。留取病变明显的结肠组织标本，部分结肠组织用质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定，余下冻存于-80 ℃备用。

1.2.3 结肠组织病理学检测：将小鼠结肠组织置于质量浓度为40 g/L的多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，4 μm切片，进行HE染色，光学显微镜下进行组织病理学观察，并进行结肠组织病理学评分[14]。

1.2.4 ELISA检测血清NF-κB、TNF-α、IL-6表达：小鼠血清中NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白水平的测定严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，450 nm的波长测量各孔的OD值，根据OD值和标准品的浓度得出标准曲线方程，代入OD值计算样品浓度。

1.2.5 Western blotting检测结肠组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达：将所取肠组织标本研磨粉碎后，加入6倍剂量的冷蛋白裂解液制缓冲液。每样品取20 μg蛋白上样，根据蛋白分子量配置SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶80 V 40 min，分离胶120 V 50 min后，当染料到达胶底部时即可终止电泳，转膜至PVDF膜。质量浓度为50 g/L的脱脂奶封闭2 h，加入一抗：TLR4(1∶500)、MyD88(1∶1 000)、NF-κB(1∶2 000)、β-actin(1∶1 000)封闭过夜。根据一抗来源，加入稀释好的二抗，室温孵育2 h，漂洗后，ECL化学发光检测，分析胶片灰度值。

2 结果

2.1模型评估及体质量改变DSS造模后，模型组与AM组小鼠相比，精神状态变差，活动量减少，体质量减轻，大便变细变稀，严重者可见黏液脓血便，实验过程中无动物死亡。根据各组小鼠体质量变化，绘制曲线图。从图1中可以看出，AM干预组小鼠在给予AM干预后体质量减轻情况较模型组有明显改善。

图1 小鼠体质量变化曲线 Fig 1 Body mass change curve in mice

2.2三组小鼠结肠DAI、CMDI及结肠组织病理学评分模型组小鼠DAI、肠黏膜及组织学损伤评分均显著高于正常对照组和AM干预组，差异有统计学意义(P<0.01，见表1)。

表1 三组小鼠的DAI、CMDI及结肠组织病理学评分Tab 1 The DAI, CMDI and histopathological score of colon tissues in three groups of mice

注：与正常对照组相比，*P<0.01；与模型组相比，△P<0.01。

正常对照组小鼠结肠黏膜色泽正常，光镜下黏膜结构完整，腺体排列整齐；模型组小鼠结肠出现扩张水肿，肠壁增厚且与周围组织粘连，剖开可见多发溃疡病灶，光镜下部分肠黏膜坏死脱落，绒毛结构破坏，腺体排列紊乱，可见大量炎性细胞浸润，杯状细胞减少，且伴有隐窝脓肿；AM干预组小鼠结肠黏膜轻度充血水肿，腺体排列尚整齐，未见明显溃疡形成，炎性细胞浸润较模型组明显减轻(见图2)。

图2 小鼠结肠组织病理学改变(HE 400×) A：正常对照组；B：模型组；C：AM干预组Fig 2 The pathological changes of mice colon tissues in different groups (HE 400×) A: normal control group; B: model group; C: AM intervention group

2.3三组小鼠结肠组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达与正常对照组相比，模型组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表达水平均显著升高(P<0.01)；给予AM干预后，三种蛋白的表达较模型组均降低(P<0.05，见图3)。

注：1：正常对照组；2：模型组；3：AM干预组。与正常对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。图3 各组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达的变化Fig 3 Changes of TLR4, MyD88 and NF-κB proteins expressions in each group

2.4AM对小鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6的影响ELISA检测结果显示，与对照组相比，NF-κB、TNF-α及IL-6在模型组小鼠血清中呈高表达(P<0.01)；而AM干预后，三者的表达较模型组均明显降低(P<0.05，见图4)。

注：1：正常对照组；2：模型组；3：AM干预组。与正常对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。图4 各组小鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6的表达Fig 4 Expressions of serum NF-κB, TNF-α and IL-6 in mice of each group

3 讨论

UC是一种非特异性肠道炎症性疾病。近年来，随着我国经济发展、人民生活水平的提高及现代饮食方式和生活作息的改变，UC在我国的发病率呈上升趋势，逐渐成为我国消化系统常见病[15]。因此，研究UC的发病机制，对治疗UC具有一定的临床价值。目前为止，UC的发病机制尚不十分清楚，近年来研究表明[16]，肠道黏膜免疫系统紊乱与UC的病情发展密切相关。TLR4作为肠道重要的病原相关模式受体，在机体免疫系统激活介导的反应中发挥着重要作用，细菌代谢产物往往通过激活跨膜TLR4及其介导的MyD88途径诱导炎症介质的产生及聚集，参与免疫应答，导致机体免疫及防御系统过度激活，体内释放大量炎症因子，最终导致疾病的发生。陈晓等[17]发现，结肠炎模型大鼠MyD88的表达明显高于正常对照组，且与炎症程度相关，说明MyD88可能是反映UC严重程度的参考指标之一。NF-κB在UC的发生、发展中作为一种重要的转录因子，是多种信号传导途径的汇聚点，在调节炎性反应的基因中起关键作用。研究[18-19]发现，与对照组相比，UC组的结肠组织NF-κB的表达增高，且NF-κB在UC患者肠道黏膜上皮、隐窝上皮和固有层单核细胞中高度表达，同时在细胞核的表达也明显高于细胞质。由此可见，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在UC致病过程中具有关键作用，抑制该信号通路或阻断其任一环节的作用，可能减轻UC的炎症反应，从而起到临床治疗作用。本实验中，模型组小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路三种蛋白的表达均明显增高，其血清中TNF-α、IL-6的表达也相应增加，而采用AM进行干预后，上述各节点蛋白及相关炎症因子的表达均下调，提示AM可能是通过抗炎作用对UC小鼠起到了治疗作用。

AM是一种由52个氨基酸组成的多肽，最早从人的嗜铬细胞瘤中分离发现，具有多种生物学作用[7-8]。鉴于AM在胃和结肠组织中的高浓度表达，以往研究[20-21]表明，AM有保护肠黏膜屏障并显著降低肠黏膜通透性的作用，可以在胃肠道上皮细胞中以自分泌或旁分泌的形式保护胃肠黏膜免受各种伤害，并促进如胃溃疡、IBD等疾病的愈合。ASHIZUKA等[22]认为，AM可以通过抑制炎症因子及发挥抗菌作用，从而对实验性结肠炎起到治疗作用。彭颖等[11]研究表明，AM对TNBS诱导的实验性结肠炎具有一定的保护作用，其机制可能是抑制了RhoA介导的NF-κB p65/MLCK信号通路的活化。近年来，有学者[23-24]进行了临床试验，通过静脉输注AM的方式治疗难治性UC患者，结果证实AM可以使难治性UC患者临床症状缓解、镜下结肠黏膜炎症浸润减轻，同时还可以刺激黏膜再生，并且发现无明显的不良反应，从而推测AM可能会成为今后一种临床治疗UC有效的药物。然而，具体的作用机制却鲜有报道。本次实验中，模型组大鼠DAI、CMDI及组织病理学损伤评分均显著高于正常对照组和AM干预组，且给予AM干预后，AM干预组小鼠精神状态变好，活动量增加，体质量增加，结肠组织损伤情况得到改善，TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表达明显减少，炎症因子TNF-α、IL-6的表达下调，进一步验证了AM可能的作用机制。

综上所述，AM可以改善DSS诱导的实验性UC小鼠的结肠损伤，其机制可能是通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，下调TNF-α、IL-6等炎症因子表达，从而发挥对实验性UC小鼠的治疗作用。但本实验只是对AM改善UC模型小鼠可能的作用机制进行了初步探讨，更详尽的机制仍需扩大动物实验样本量进行深入的研究。