全谱氨基酸代谢组学在胃癌诊断中的应用

刘 健， 闫秀娥， 周丽雅， 林三仁

北京大学第三医院消化科，北京 100191

我国是胃癌的高发地区，但早期胃癌(early gastric cancer，EGC)发现率仅为10%～20%，多数患者就诊时已处于进展期，预后较差[1]。因此，胃癌的早期防控对于改善患者预后及降低医疗负担至关重要[2]。然而，目前临床上常用的血清学肿瘤标志物，如癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)和糖链抗原19-9(CA19-9)等的灵敏度不足以用于胃癌，特别是EGC的诊断和筛查[3]。所以，寻找简便、经济、高效的早癌筛查手段是符合我国国情的重要研究课题，意义深远。

近年来随着检测技术和分析方法的飞速进步，医学实践正向个体化医学与精准医学迈进。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门新兴学科，已被广泛用于疾病诊断、生物标志物筛选、药物疗效和毒性评估等领域[4]。但代谢组学作为系统生物学的一个重要分支，其研究方法也存在一定的缺点，如信息量大、需要专门的仪器和统计分析软件、检测费用高等。代谢轮廓分析是指对某一类结构或功能相似或具有共同代谢通路的物质进行检测，弥补了代谢组学上述缺点，并继承了其分辨率高、选择性好、灵敏度高等优点[5]。在所有候选代谢物中氨基酸是最适合的物质之一。因为氨基酸既可以被消化吸收，又可以内源性合成，是合成蛋白质结构的基本单位，也是嘌呤和嘧啶核苷酸生物合成的前体，在机体的基础代谢及代谢物的调节中均起着关键性的作用[6]。因此，全谱氨基酸代谢组学检测技术作为精准医疗的重要手段，已在包括胃癌在内的多种实体瘤诊断中得到广泛应用[7-9]。本文就其在胃癌诊断中的应用进展作一概述。

1 不同检测方法的氨基酸代谢组学在胃癌诊断中的应用

目前代谢组学的检测方法主要包括高效液相色谱串联质谱(high performance liquid chromatography-tandom mass spectrometry，HPLC/MS)、气相色谱串联质谱(gas chromatography-tandom mass spectrometry，GC/MS)和核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance，NMR)。基于上述各种检测平台已有一系列氨基酸代谢组学研究应用于胃癌诊断。如JING等[10]应用HPLC/MS法对84例胃癌和82例胃溃疡患者血清氨基酸代谢谱进行检测发现，胃癌组血清中谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸和色氨酸浓度显著降低(P<0.01)，鸟氨酸浓度显著升高(P<0.001)，联合检测上述5种氨基酸用于胃癌诊断的ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.922，灵敏度和特异度分别为89.1%和85.5%。LIANG等[11]同样应用HPLC/MS法对4例胃癌患者和9名健康对照者尿液代谢谱进行检测发现，胃癌组尿液中甘氨酸浓度显著降低(P<0.01)，丙氨酸、脯氨酸、牛磺酸和尿素浓度显著升高(P<0.05)，代谢通路分析结果表明上述差异与氰基氨基酸代谢、初级胆汁酸生物合成及精氨酸和脯氨酸代谢关系密切。相似的是，KULIGOWSKI等[12]应用超高效液相色谱串联质谱(UPLC/MS)法对33例胃癌和110例胃良性病变(non-neoplastic gastric diseases，NGD)患者血浆代谢谱进行检测发现，胃癌组血浆中色氨酸浓度显著降低(P<0.05)，犬尿氨酸浓度显著升高(P<0.05)，因此，推测上述差异可能是由于胃癌组织上调吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)的表达所致。WU等[13]应用GC/MS法对18例胃癌患者癌组织和癌旁组织代谢谱进行检测发现，胃癌组织中缬氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺和磷酸丝氨酸浓度显著降低(P<0.05)，异亮氨酸浓度显著升高(P<0.05)，联合检测包含上述5种氨基酸在内的18种代谢物用于胃癌诊断的AUC为0.963。SONG等[14]同样应用GC/MS法对30例胃癌患者和30名健康对照者血清代谢谱进行检测发现，胃癌组血清中谷氨酰胺浓度显著降低(P<0.05)，缬氨酸浓度显著升高(P<0.05)，上述差异与胃癌患者氨基酸代谢紊乱密切相关。CHAN等[15]应用核磁共振波谱(NMR)法对43例胃癌患者和40名健康对照者尿液代谢谱进行检测发现，胃癌组较健康对照组尿液中丙氨酸等3种小分子化合物的浓度显著升高(P<0.001)，应用这3种差异代谢物进行胃癌诊断的AUC为0.950。作者认为，上述研究结果的不同，除了与检测方法和对照组病变的严重程度不同以外，还可能与检测标本的类型不同有关。

2 不同样本类型的氨基酸代谢组学在胃癌诊断中的应用

目前用于胃癌诊断的氨基酸代谢组学研究的标本类型主要包括血浆、组织、尿液和胃液。

2.1血浆游离氨基酸代谢谱与胃癌诊断血浆游离氨基酸(plasma free amino acids，PFAAs)在外周循环中含量丰富，作为联系全身各器官的介质，样本收集及分析方法相对简单，对患者的生理负担也相对较小[16]。为探讨PFAAs谱用于癌症诊断的价值，MIYAGI等[17]应用HPLC/MS法对来自3个医疗中心约1 000例癌症患者(包括胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌患者各200例)及1 000名性别和年龄匹配的健康对照者PFAAs谱进行检测。结果表明，除了前列腺癌以外，其余4种类型癌症患者血浆中谷氨酰胺、组氨酸和色氨酸浓度均显著降低(P<0.01)。但并未见任何一种PFAA的浓度在上述5种类型癌症患者中均显著升高。而某些PFAAs在不同类型癌症患者中的浓度变化趋势恰好相反。例如，在胃癌和结直肠癌患者血浆中苏氨酸的浓度显著降低(P<0.001)，但在乳腺癌患者血浆中却显著升高(P<0.001)，说明PFAAs谱可能具有一定的器官特异性。在另一项研究中，GU等[18]应用氨基酸分析仪对117例肿瘤患者(包括胃癌56例、乳腺癌28例和甲状腺癌33例)及137名健康对照者PFAAs谱进行检测。结果显示，与健康对照组相比，肿瘤组患者血浆中苏氨酸和精氨酸浓度均显著升高(P<0.001)，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和脯氨酸浓度均显著降低(P<0.01)。但上述三种类型肿瘤患者的PFAAs谱却不尽相同，如早期胃癌组浓度显著降低的PFAAs还有丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸和组氨酸(P<0.01)，显著升高的PFAAs还有半胱氨酸(P<0.001)；乳腺癌组浓度显著降低的PFAAs还有组氨酸(P<0.001)；甲状腺癌组浓度显著升高的PFAAs还有甲硫氨酸、亮氨酸、苏氨酸和赖氨酸(P<0.05)。这提示不同类型肿瘤可能存在相对特异的PFAAs代谢谱。因此，PFAAs谱检测有望成为一项极具临床应用前景的胃癌诊断和筛查方法。

2.2组织游离氨基酸代谢谱与胃癌诊断为满足肿瘤细胞无限增殖的需求，肿瘤组织需从癌旁组织及血液循环中富集氨基酸等营养物质满足自身生长需要。近年来有几项研究对这一现象进行了报道。如HIRAYAMA等[19]应用毛细血管电泳串联飞行时间质谱(CE/TOFMS)法对12例胃癌和16例结肠癌患者癌组织和癌旁组织代谢谱进行检测发现，除谷氨酰胺外，几乎所有其他类型的氨基酸都在肿瘤组织周围异常积聚，表示肿瘤自噬性降解，谷氨酰胺分解及产能代谢活跃。此外，三羧酸循环中间代谢产物的浓度在胃和结肠组织中差异有显著统计学意义，说明不同组织类型的生物标本获取氧气的量和能力不同，对无氧酵解的耐受程度也不同。总之，肿瘤组织微环境营养状况不佳，应用CE/TOFMS法对组织中能量代谢及氨基酸代谢进行定量检测有望研发出一种新型抗癌药，其抗癌靶点为癌症相关的特异性代谢通路。为明确局部肿瘤组织对全身代谢的影响及肿瘤微环境与外周体液间的联系，AA等[20]对17例胃癌和20例慢性浅表性胃炎(chronic superficial gastritis，CSG)患者组织和血清代谢谱同时进行检测。结果表明，与CSG患者相比，胃癌患者组织和血浆均呈截然不同的代谢表型，且胃癌组织和血浆中代谢物浓度变化趋势也不尽相同。例如，胃癌组组织中三羧酸循环中间代谢产物、乳酸、氨基酸和脂肪酸浓度均显著高于CSG组(P<0.05)，血浆中上述代谢产物的浓度却显著低于CSG组(P<0.05)。证实肿瘤微环境与循环体液中代谢产物的浓度之间存在平衡关系。

2.3尿液游离氨基酸代谢谱与胃癌诊断尿液作为一种生理性体液，含量巨大，可再生性强，是一种理想的无创性检验标本[21]。作为一种外周体液，尿液和血液一样，也可以反映消化系统及全身各器官的代谢状况。FAN等[22]应用离子色谱法对23例胃癌患者和15名健康对照者尿液游离氨基酸(urine free amino acids，UFAAs)谱进行检测发现，胃癌组UFAAs谱较健康对照组差异有显著统计学意义。与健康对照组相比，胃癌组尿液中缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸浓度显著升高(P<0.05)，甲硫氨酸、组氨酸和天冬氨酸浓度显著降低(P<0.05)。此外，EGC和进展期胃癌(advanced gastric cancer，AGC)患者间UFAAs谱差异也有显著统计学意义。由此可见，UFAAs谱对胃癌的早期诊断和筛查具有潜在临床应用价值。JUNG等[23]应用NMR法对50例胃癌患者和50名健康对照者的尿液标本进行检测发现，胃癌组尿液中丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸浓度均显著升高(P<0.001)；对其中30例胃癌患者的癌组织及癌旁组织标本进行检测发现，胃癌组织中亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸浓度显著升高(P<0.001)。多变量统计分析结果表明，两组患者尿液和组织代谢谱间差异均有显著统计学意义，且胃癌组尿液氨基酸及磷脂代谢相关的代谢产物浓度变化趋势与胃癌组织相一致。因此，UFAAs谱有可能成为监测胃癌发生、发展的一种新方法。

2.4胃液游离氨基酸代谢谱与胃癌诊断胃液与胃黏膜组织密切接触，内部蕴藏着大量反映胃黏膜细胞代谢状况的信息[24]。与胃黏膜组织活检相比，胃液收集方法简便，且相对无创，是液态活检的理想标本[25]。因此，通过检测胃液游离氨基酸(gastric juice free amino acids，GJFAAs)谱可以间接了解胃癌组织氨基酸代谢的变化特点及潜在机制，并从中筛选新型的生物标志物[26]。有关GJFAAs谱的研究由来已久，1958年OH-UTI等[27]应用放射性纸层析法对68例胃癌、31例消化性溃疡和14名健康对照者15种GJFAAs浓度进行检测发现，胃癌组患者胃液中亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸等7种GJFAAs的浓度较健康对照组和消化性溃疡组显著升高(P<0.05)；且胃癌术后大部分GJFAAs浓度恢复正常，提示动态监测GJFAAs浓度有助于胃癌的诊断和疗效评估。随后，ABASOV[28]应用纸上层析辐射法结合茚三酮反应对100例胃癌、115例NGD和25名健康对照者GJFAAs浓度进行半定量检测，结果显示，丙氨酸和亮氨酸在胃癌组患者胃液中的浓度较健康对照组和NGD组均升高2倍以上(P<0.05)。1985年SEGAWA等[29]应用高效液相色谱(HPLC)法对16例胃癌、31例消化性溃疡患者和9名健康对照者GJFAAs浓度进行检测，结果表明，胃癌组GJFAAs浓度较消化性溃疡组和健康对照组均显著升高，其中10种GJFAAs的浓度升高2倍以上，以丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸和缬氨酸的浓度升高最显著(P<0.001)。我课题组前期研究发现，三种胃液芳香族氨基酸(aromatic amino acids，AAAs)可以用于鉴别EGC和AGC与NGD[30-32]。后续机制研究结果显示，早期胃癌组织通过上调基质金属蛋白酶-2/9(MMP-2/9)蛋白的表达，降解细胞外基质和基底膜中Ⅳ型胶原蛋白，可能是引起胃癌患者胃液AAAs浓度异常升高的原因之一[33]。为进一步探讨胃癌和NGD患者GJFAAs代谢轮廓的差异，并筛选具有诊断意义的GJFAAs，LIU等[34]连续收集130例(包括47例胃癌和83例NGD患者)于我中心接受胃镜检查且病理诊断明确患者的胃液标本，应用全自动氨基酸分析仪对上述患者包括8种必需氨基酸和20种编码氨基酸在内的34种GJFAAs浓度进行检测。通过多变量结合单变量统计分析的方法，共筛选出14种差异GJFAAs，其用于胃癌诊断的AUC为0.666～0.868，联合检测AUC为0.902(95%CI：0.846～0.959)；更重要的是，其用于EGC诊断的AUC为0.649～0.857，联合检测AUC为0.880(95%CI：0.792～0.969)。代谢通路分析结果显示，14种差异GJFAAs主要分布在8条代谢通路上，与上述GJFAAs浓度差异相关性最高的为氨基酰tRNA生物合成代谢通路。这说明两组患者GJFAAs浓度的差异与胃癌组织快速增殖过程中旺盛的蛋白质生物合成关系密切。因此，GJFAAs谱检测有望成为胃癌早期诊断的新方法，并可以用于补充组织和外周体液中氨基酸的代谢信息，更好地为胃癌发病机制及治疗靶点的研究提供理论和实验依据。

综上所述，胃癌患者不同类型标本中游离氨基酸谱的表达模式大致如下：大部分游离氨基酸的浓度在胃癌组织、胃液和尿液中呈上升趋势，在外周血中呈下降趋势。这可能与肿瘤组织对营养物质的大量需求导致肿瘤局部及全身代谢紊乱有关。基于同一标本类型不同研究报道的结果不尽相同，不仅与其应用的检测方法不同有关，而且与样本量相对较小、肿瘤的异质性及对照组病变的严重程度不同有关。导致胃癌患者氨基酸代谢失衡的原因尚不明确，有待于深入研究加以证实。总之，以人体组织和体液为基础的全谱氨基酸代谢组学有望成为早期胃癌诊断、筛查和动态监测的新方法，并为胃癌发生的病理学机理研究提供新思路。