骨穿刺活检针制作的乳腺癌组织芯片中Gankyrin的表达*

张小容 徐 晓 程 林

(九江学院附属医院 江西九江 332000)

乳腺癌已经超过肺癌成为全世界女性最常见的恶性肿瘤，在欧美国家乳腺癌的发病率占女性恶性肿瘤发病的首位。目前，中国虽属乳腺癌低发国家，但随着社会经济水平发展及人们生活方式西方化改变，其发病率增长迅猛。同时中国人口基数大，而且发病高峰年龄较欧美国家偏低，这些因素促使中国乳腺癌发病例数快速增加，严重威胁着广大女性的健康和生命。尽管乳腺癌治疗方法众多，靶向治疗仍然是主要治疗手段之一。选择可能的分子靶点，应用靶向药物实施个体化治疗将是乳腺癌治疗的主要趋势，因此检测乳腺癌中可能的药物治疗靶点成为最主要的研究方向。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2010-2016年九江学院附属医院病理科存档的临床病理资料齐全的乳腺癌标本73例，患者均为女性，年龄30～65岁，中位年龄49岁。所以患者术前均未行放疗、化疗等抗肿瘤治疗。

1.2 主要试剂

兔Gankyrin单克隆抗体(货号：SC-101498)购于美国santa Gruz公司，P53(DO-7)即用型快捷免疫组化Max Vision试剂盒及DAB显示试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 组织芯片的制作 收集73例乳腺癌组织蜡块和24例腺病组织蜡块，首先进行切片HE染色，并进行形态学观察，在蜡块上选取组织结构完好，具有代表性的病变部位用标记笔画圈作出标记。制作3个3.7cm×2.4cm×0.7cm大小的空白蜡块，设计成5×8的组织微列阵。用骨穿刺活检针(见图1)针管打孔制成受体模块，孔径 2.0mm。用穿刺针从供体蜡块标记部位逐个取出组织芯，随即放入预先制备的受体模块中，每个模块起始端第一排分别用肝癌、肾、脾、甲状腺、淋巴结各1例作为定位标记和对照。将受体模块至于玻片上54℃恒温箱加热30min(每隔10min观察一次，避免时间太长，引起受体模块中的石蜡融化太多，引起组织偏移原本的位置)，使组织芯片和受体蜡块相互融合，以玻片上出现一层薄薄的液体石蜡为宜。再用写好标记的组织包埋盒将含组织芯片的蜡块整个再次包埋，室温放置30min后冷冻30min(避免包埋后直接冷冻，温差太大，容易造成组织芯与受体模块脱离)，4μm切片。

1.3.2 免疫组织化学染色 采用Max Vision法，参照试剂说明书操作。简要步骤：4μm厚石蜡切片常规脱蜡水化；柠檬酸钠缓冲液高压修复，浓缩型一抗用抗体稀释液稀释，P53、Gankyrin的稀释度分别为1∶100和1∶50。4℃过夜，滴加二抗，DAB显色，复染，脱水，封片。用PBS液代替一抗作阴性对照。

1.3.3 结果判定 判断标准：①Gankyrin蛋白是细胞浆、胞核呈黄色或棕黄色被判定为阳性信号，P53定位于细胞核，着色强度无、弱、一般及强阳性分别为0、1、2及3分。②着色细胞比例0、<25%、25%～50%、50%～75%、>75%分别计分为0、1、2、3、4 分。③着色强度与着色细胞比例两组分值相加<3 被认为阴性(-)，≥3被认为阳性(+)。染色结果由两位副主任以上职称的病理医师阅片。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。样本率的比较应用χ2检验，以p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨穿刺活检针

骨穿刺活检针(见图1)用于取样2mm直径组织样本。A主要用于打受体模块的组织孔及取样，针芯B将所取的组织芯片取出来。制备的组织芯片，阵列保持良好，标记位置清晰可见，偶有移位现象，组织芯与蜡块表面没有明显凹凸不平现象，切片HE染色组织排列尚整齐，偶有移位及掉片(见图2)。

图1 骨穿刺活检针

图2 组织芯片切片(HE染色)

由图2可见，组织芯片经切片染色后整体保存较完整，偶有移位及掉片。

2.2 Gankyrin、P53蛋白在乳腺癌组织中的表达

Gankyrin主要表达于乳腺癌的细胞核和细胞质中(见图3)，P53表达于癌细胞的细胞质中(见图4)。73例乳腺癌组织中Gankyrin及P53的阳性率分别为60.2%、27.4%；24例乳腺腺病组织中Gankyrin及P53的阳性率分别为4.0%、0。Gankyrin及P53在乳腺癌及乳腺腺病组织中表达，差异有统计学意义(p<0.05)(见表1)。

图3 乳腺癌组织中Gankyrin的表达(Max Vision法10×)

图4 乳腺癌组织中P53的表达(Max Vision法 10×)

分组nGankyrin - + χ2 p值 p值 - + χ2 p值 乳腺癌组织73294422.863<0.0153206.6940.01腺病2423 1240

注：p<0.05为差异有统计学意义。

3 讨论

组织芯片技术[1](tissue chip，Tc)又称为组织微阵列(tissue microarray， TMA)，是将10个以上组织样本，有序地排列在同一张载玻片上，而形成的微缩组织切片进行组织学研究。由于芯片的制作能大大降低实验成本及工作量，而且实验结果可靠，能明显降低实验误差等优点，广泛应用于基础研究及免疫组化阳性对照的建立。目前组织芯片的制作有商品化的组织芯片仪及手工制作两种方法，但前者价格昂贵，应用受限。因此，手工制作芯片应用更广泛[2]。

该实验运用骨穿刺活检针成功制作了乳腺癌组织芯片。该芯片组织直径2mm，能确保足够量的组织进行实验，相比较于组织微阵列制作仪制作的直径0.9mm的组织芯片[3]而言能容纳更多的组织，提高实验的成功率，而且该方法成本低，可广泛应用于基础研究及免疫组化阳性组织芯片的制作。

癌性锚蛋白重复序列(Gankyrin)又称为PSMD10、p28、Nas6p，是2000年由日本学者Higashitsuji等[4]肝癌组织发现的一种原癌基因。它属于锚蛋白家族成员，由7个锚蛋白重复序列组成，大小为25KDa，包括226个氨基酸，定位于人染色体xq22.3，在哺乳动物中高度保守[5-6]。近年来，研究者相继对胰腺癌[7]、膀胱尿路上皮癌[8]、结直肠癌[9]等进行研究发现，Gankyrin在这些肿瘤细胞中高表达。该实验研究发现Gankyrin在乳腺癌中高表达，阳性率为60.2%，与正常乳腺组织相比，差异有统计学意义。p53作为一种抑癌基因，几乎存在于所有肿瘤细胞中，该实验研究表明，P53在乳腺癌组织中阳性率为27.4%，而在正常乳腺组织中无表达。有相关研究表明Gankyrin可与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)及鼠双微体基因表达产物(MDM2)相结合，介导Rb引起的P53泛素化降解，是促进恶性肿瘤细胞的增殖、抑制其凋亡[10-11]。

综上所述，Gankyrin在乳腺癌中高表达，可能会促进肿瘤的增殖，抑制肿瘤凋亡，影响患者预后。在后续的实验研究中，将重点分析Gankyrin与临床特征的关系，以及与P53的相关性进行分析。