美国国家家禽改良计划标准程序（2014版）—血液检测程序（2）

2019-01-22译校张倩张淼洁翟新验中国动物疫病预防控制中心

中国畜牧业 2019年2期

关键词：稀释液支原体抗原

译校│张倩张淼洁翟新验（中国动物疫病预防控制中心）

5 判断对禽群有鸡毒支原体、滑液囊支原体和火鸡支原体阳性反应状态的程序（血液检测程序1～4请见本刊2019年1期）

美国病理学家协会（AAAP）出版的《禽类病原体、禽类支原体病（鸡毒支原体）分离、鉴定和特性方法实验室手册》、世界动物卫生组织2004年出版的第五版《陆生动物诊断试验和疫苗手册》，以及本标准程序记录了分离和鉴定支原体的程序。

（a）确定禽群支原体感染状态。应根据以下标准确定禽群的支原体感染状态：

（1）如果酶联免疫吸附测定（ELISA）、官方分子检查程序或血清平板试验结果呈阴性，则鸡群符合阴性群的分类。

（2）如果酶联免疫吸附测定或血清平板试验结果呈阳性，则应进行红细胞凝集抑制试验或执行分子检查程序：若超过50%的样本为鸡毒支原体、火鸡支原体或鸡毒霉形体阳性，则进行红细胞凝集抑制试验时，应选择10%的阳性样本或25个阳性样本进行试验，以数量较大者为准。1∶40或更高比例的红细胞凝集抑制效价可被解释为可疑反应，应立即（从最初采样算起7天内）从临床检测出受感染的30只家禽体内采集合适的抗原检测标本，并用获批的培养技术检查每一只家禽，或用分子检测程序或体内生物鉴定试验进行混样检测（每一次的检测量多达5个拭子）。

（3）如果体内生物鉴定、分子检查程序或培养程序的结果呈阴性，则该禽群通过检测，官方机构应认证其符合阴性群的分类。当培养液受到污染时，必须运用分子检查技术做出最终裁定。

（4）如果体内生物鉴定、分子检查程序或培养程序的结果呈阳性，则可认为该禽群已受到感染。

6 支原体标准检测程序

血清平板凝集试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）是基本的支原体抗体筛选检测试验。选择哪一种检测取决于偏好、实验室设施和可获得的抗原。尽管这两种检测都相当准确，但由于偶然存在非特异性反应，这些检测只能测定禽群的状态，而不能测定单独某只禽的状态。在正常情况下，发生这种非特异性反应的概率很低，尤其是在火鸡身上使用了丹毒菌苗以后，用支原体抗体检测密切相关的支原体的偶尔非特异性反应的发生率会很高。就常规筛查而言，红细胞凝集抑制试验阳性反应非常准确，但有些过于烦琐，只在评价与酶联免疫吸附试验和平皿抗原起反应的血清标本时有帮助。应以4个红细胞凝集单位为标准进行检测。当鸡和火鸡血清的效价为1∶80或更高时，结果为阳性；为1∶40时，结果为可疑，则需要进行额外的检测。

（a）血清平板凝集试验。用来检测支原体的血清平板凝集试验应按照《国家家禽改良计划》（NPIP）批准的生产商的指示进行，每检测一个样本时，都应根据已知的阳性和阴性对照血清来测试抗原。可从国家兽医服务实验室（NVSL）获得阴性和阳性血清。另外还可以通过商业途径购买到阳性和阴性质控血清。

（b）红细胞凝集抑制试验。支原体红细胞凝集抑制反应试验通过抗原量不变，血清量降低的方法进行。该方法需要用到4个红细胞凝集单位的稀释抗原。用到的红细胞凝集单位数目的变化会显著地改变阳性血清效价。针对鸡毒支原体、滑液囊支原体和火鸡支原体的标准红细胞凝集抗原可从国家兽医服务实验室获得。该抗原已按照1∶640的比例进行滴定和稀释。在首次使用或长时间储存后，应按照段落（b）（2）（ii）或（b）（3）（ii）中所述的方法检查每一个样本的红细胞凝集效价。为了保持抗原的红细胞凝集活性，未稀释的红细胞凝集抗原应保存在零下60℃至零下70℃的环境中。

（1）材料的准备。（i）按表1配备磷酸缓冲盐溶液（PBS）∶

表1 配备磷酸缓冲盐溶液成分

若所有试剂都测量准确的话，磷酸盐缓冲溶液的酸碱度（pH）将在7.1～7.2。

（ii）采集火鸡或鸡的红细胞（RBC's）放置在肝素（1000单位/毫升）或阿氏液中保存，阿氏液的配制方法如表2：

表2 阿氏液的配制成分

将柠檬酸钠和氯化钠溶于800毫升的蒸馏水中，并在15磅的压力下灭菌15分钟。

将葡萄糖溶于200毫升的蒸馏水中，用蔡氏过滤器或其他类型的过滤器对其进行灭菌，然后通过无菌操作将其加入无菌的柠檬酸钠和氯化钠溶液中。

（iii）从已知的不含所检测支原体的火鸡或鸡身上，用含有肝素（每10毫升血液中大约含有0.2毫升肝素）或阿氏液的注射器，按照1∶5的比例（如：8毫升的血液配40毫升的阿氏液）抽取足量的血液。对血液离心10分钟，转速为1000rpm（转/分钟），然后用移液管去除上层清液。

（iv）用10倍量或更多份阿氏液或缓冲盐水清洗红细胞两次，每一次清洗后都需以每分钟1000rpm的转速离心10分钟。去除上清液后，用阿氏液或缓冲盐水对红细胞沉积物做悬浮处理，确保浓缩红细胞在悬浮液中的浓度为25%（无论是检测鸡血清还是火鸡血清，都必须使用同源的红细胞，即检测鸡血清时要用鸡的红细胞，检测火鸡血清时，则需用到火鸡的红细胞）。若悬浮液需冷藏保存，则保存时间为采血后的7至8天。

（v）检测时，将2毫升红细胞浓度为25%的悬浮液加入到98毫升的缓冲盐水中，制成终浓度为0.25%的红细胞悬浮液。

（2）程序1。（i）所需材料：微量滴定仪（最小）；即微孔板、微量稀释器、微量移液器、极限稀释转移测量仪（0.05毫升）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）；从国家兽医服务实验室获得的试剂，即红细胞凝集抗原和待检测支原体的滴定过的阴性和阳性血清；从未感染待检测支原体的禽类体内获得的终浓度为0.5%（2毫升红细胞浓度为25%的悬浮液加入到98毫升的磷酸盐缓冲溶液中配备而来）的同源红细胞（RBCs）悬浮液。见本节段落（d）（1）（ii）至（v）有关红细胞配制的介绍。

（ii）红细胞凝集（HA）抗原滴定。标记出抗原滴定试验的每一个孔，共两排，每排10个孔（红细胞凝集抗原滴定试验需设置复孔检测）；标记出每一排中最后一个孔，作为对照组；在小试管（12×75毫米）中，将0.1毫升的抗原与0.9毫升的磷酸缓冲盐溶液混合，配制比例为1∶10的起始抗原稀释液；向所有孔中加入0.05毫升的磷酸缓冲盐溶液，包括对照组；将0.05毫升的抗原稀释液（1∶10稀释）加入到两排的第1个孔中，充分混匀后，将稀释液转移到每排的第2个孔中进行混匀，以此类推一直到每排的第10个孔，用分装检测卡检查从最后一个孔中取出稀释液混合物，然后将稀释液放入蒸馏水中，如果稀释液检查有效，抗原稀释度将依次为1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120；用容量为0.05毫升的滴管向所有孔中加入0.05毫升浓度为0.5%的红细胞悬浮液；若微孔板还需放置两小时以上时，则将微孔板密封。摇动微孔板并于室温下静置，直到对照组中的细胞聚集成紧凑的纽扣状。滴度是能产生完整凝集反应的最高稀释度。0.05毫升稀释液中包含1个红细胞凝集单位；配制0.05毫升含8个红细胞凝集单位的抗原稀释液。例如：若抗原滴度为1∶640，则每0.05毫升的抗原稀释液中含1个红细胞凝集单位。用640除以8得80，那么1∶80稀释的抗原稀释液中含8个红细胞凝集单位。用640除以4得160，那么1∶160稀释后每0.05毫升的抗原稀释中含有4个红细胞凝集单位（见表3）。

表3 红细胞凝集抑制试验的样本结果（试管和血清稀释）

（iii）血凝抑制试验。配制两份抗原稀释液，一份每0.05毫升包含8个红细胞凝集单位，一份每0.05毫升包含4个红细胞凝集单位。后者可通过往前者中混入等量的磷酸缓冲盐溶液而获得。每项检测需标记出一排8个孔。

在小试管（12×75毫米）中配制每种待检测血清1∶5的稀释液：0.1毫升血清加0.4毫升磷酸盐缓冲溶液或0.05毫升血清加0.20毫升磷酸盐缓冲溶液。

用容量为0.05毫升的滴管将0.05毫升的磷酸盐缓冲溶液加入到每排最后一个孔中。

将0.05毫升含8个红细胞凝集单位的抗原加入到每排的第2个孔中。

将0.05毫升含4个红细胞凝集单位的抗原加入到每排第3至8个孔中。

针对每份待检测血清，在每排第1个孔，加入0.05毫升的稀释液和上文第（iii）段配制的将1∶5稀释的血清。

混合均匀后，从第1个孔中吸取血清稀释液，转移到第2个孔中，依次进行两倍稀释操作一直到第8个孔。

第1个孔（血清稀释度为1∶10）为血清对照组。第2个孔＝1∶20稀释度；第3个孔＝ 1∶40稀释度；第4个孔＝1∶80稀释度；第5个孔＝1∶160稀释度；第6个孔＝1∶320稀释度；第7个孔＝1∶640稀释度；第8个孔＝1∶1280稀释度。

抗原对照组。标记6个孔作为抗原对照组；将0.05毫升磷酸缓冲盐溶液加入到第2、3、4、5和6个孔中；将0.05毫升含8个红细胞凝集单位的抗原加入到第1和第2个孔中；用空的稀释器，将第2个孔里的溶液混匀，并依次进行两倍稀释操作一直到第6个孔；第1个孔中包含8个红细胞凝集单位，第2个孔中包含4个红细胞凝集单位，第3个孔中包含2个红细胞凝集单位，第4个孔中包含1个红细胞凝集单位，第5个孔中包含1/2个红细胞凝集单位，第6个孔中包含1/4个红细胞凝集单位；标记两个孔作为对照组，向每个孔中加入0.05毫升磷酸盐缓冲溶液；在室温下（20～23℃）孵育20至30分钟，使抗体抗原充分发生反应，向所有孔中加入0.05毫升浓度为0.5%的红细胞悬浮液；密封所有的孔（如果反应孔需放置2小时以上时）。充分摇匀微孔板；在室温下孵育30至45分钟。

解释：血凝抑制效价是当反应板倾斜时通过红细胞流下时，能够呈现完整的红细胞凝集抑制反应的最高血清稀释度。效价为1∶80或更高的血清被视为阳性，效价为1∶40的被视为可疑。样本检测结果如本段表1所示。

（iv）如果不确定血凝试验和血凝抑制试验的检测结果，则意味着至少间隔21天后，需对样本进行病原培养。

（3）程序2。目的：通过红细胞凝集抑制试验（HI）检测禽类支原体的抗体。本试验运用抗原量不变、稀释血清的方法来测量鸡毒支原体、滑液囊支原体或火鸡支原体的抗体。

（i）所需材料。鸡毒支原体、滑液囊支原体，火鸡支原体血凝抑制抗原；阳性和阴性对照血清；磷酸盐缓冲溶液；96孔U型底微量滴定板；12道移液器（德国伯赫）；50微升移液器（皮佩曼，P200）；移液器吸头；含0.5%同源红细胞的磷酸盐缓冲溶液（使用来自待检测同一物种身上提取的红细胞）；封板膜；镜面读数器。

（ii）红细胞凝集（HA）抗原滴定。对支原体抗原进行标准红细胞凝集（HA）检测，以确定其抗原效价；将50微升磷酸盐缓冲溶液加入到96孔微量滴定板的3排孔中；将50微升抗原原液加入到2排孔中；用12道移液器依次进行两倍倍比稀释（50微升）。稀释比例为1∶2至1∶4096；向3排孔中加入50微升浓度为0.5%的同源红细胞。未添加抗原的那一排作为红细胞对照组。

在室温下进行孵育（大约30分钟）直到对照组红细胞凝集成紧凑的纽扣状。当最后一个孔中的红细胞呈现出完整的弥散状（红细胞凝集）时，读取红细胞凝集效价。

为进行血凝抑制试验，将抗原原液稀释成含4个红细胞凝集单位的抗原稀释液。该含4个红细胞凝集单位的抗原稀释液是用抗原原液的红细胞凝集效价除以8计算得出。（例如：1∶320红细胞凝集单位除以8等于40，按1∶40的比例稀释抗原原液）

（iii）红细胞凝集抑制试验。在96孔U底微孔板上标记出一列（A到H）为每个样本、每个阳性和阴性对照组、抗原回滴孔和红细胞对照的加样孔。

将40微升的磷酸缓冲盐溶液加入到微孔板的最上面一排（A排）的每个孔中。向该微孔板所有剩余的孔中加入25微升磷酸缓冲盐溶液。

在A排每个孔中加入每份待测血清10微升（制成比例为1∶5的血清稀释液）。

用12道移液器依次从A孔到H孔倍比稀释25微升血清稀释液。最后25微升溶液弃去，这样各排的稀释比例分别为：A排＝1∶5至H排1∶640。

用牛津剂量器，向B孔到H孔依次加入25微升含4个红细胞凝集单位的抗原。A孔为血清对照组。

通过向其中一列的每个孔中加入25微升的磷酸盐缓冲溶液来进行抗原回滴。向A孔中加入25微升的稀释抗原，然后从A至D孔依次稀释25微升，这样抗原稀释度依次为1∶2、1∶4、1∶8和1∶16。（建议在血凝抑制试验中使用抗原稀释液前，进行抗原会滴。这样就可以在不合适的抗原稀释液被用于血凝抑制试验前及时发现不合适的抗原稀释问题并进行纠正。）

其中一列孔中不添加抗原和血清，作红细胞对照组用。轻轻搅拌并在室温下孵育30分钟。

向所有孔中加入50微升浓度为0.5%的红细胞。注意：加入红细胞后不要搅动（搅拌可能会导致红细胞下沉，从而引起假阳性反应，形成“假”的纽扣状凝块）。

用封板膜盖上反应板。在室温下孵育30分钟，或直至对照组中红细胞形成一个紧凑的纽扣状凝块为止。

在镜像平板读数器上读取反应结果。

（ⅳ）结果。效价指的是形成紧凑的纽扣状红细胞的最后一个稀释度的倒数。最终稀释方案包括稀释计算中的抗原，具体如下，B＝1∶20、C＝1∶40、D＝1∶80、E＝1∶160、F＝1∶320、G＝1∶640、H＝1∶1280。

只有满足以下条件，试验才有效：阳性对照组血清效价应在此前已测定效价的一个滴度范围内；阴性对照组血清必须呈阴性；抗原回滴结果必须为1∶4或1∶8；红细胞对照组必须呈现紧凑且非溶血的纽扣状凝块；血清对照组（A排孔的每份待测血清）都不得出现非特异性凝集或溶血。如果为阴性，报告中应描述为“阴性，且无非特异性凝集或非特异性溶血”，或“由于非特异性凝集或溶血而无法评估”，或“处理血清，去除非特异性凝集，并重复试验”。

去除非特异性凝集的处理。目的：处理血清，去除影响血凝抑制试验的非特异性凝集。样本：血清。

材料：同源红细胞（鸡或火鸡），50%的磷酸盐缓冲溶液、离心机、孵化器、冰箱（4℃）。

程序：将50微升的血清加入200微升的磷酸盐缓冲溶液中，配制稀释度为1∶5的试验用血清；向磷酸盐缓冲溶液中加入等量的浓缩红细胞，配制浓度为50%的红细胞溶液。均匀混合；将25微升浓度为50%的红细胞溶液加入到血清稀释液中；轻轻搅拌混匀；在4℃下孵育1小时；离心红细胞形成小球状；用上清液进行血凝抑制试验。调整试验中的稀释方案时需考虑到处理过程中的初始1∶5血清稀释液。在1∶5的血清稀释方案中，不要在A排的孔中加入磷酸盐缓冲溶液，而要在其中加入50微升1∶5稀释的处理后的上清液。从A排到H排，依次倍比稀释25微升，这样从B排至H排血清稀释度依次为1∶10到1∶640。

7 制备诊断试验用蛋黄标本的程序

如下检测条款适用于《联邦法规汇编》中美国禽群鸡毒支原体净化相关内容、美国禽群滑液囊支原体净化相关内容、美国禽群H5/H7禽流感受到监控相关内容。

（a）在授权代理人或州检察员的监督下，用于蛋黄检测的鸡蛋必须是从种鸡群所在的养殖场中挑选而来、必须包括从该鸡群单日产出的鸡蛋中所挑选出的30个鸡蛋做代表性样本、必须标记出来源鸡群和鸡舍且必须送往授权实验室制备诊断试验用检测样本。

（b）授权实验室必须确认每个鸡蛋来自哪个种鸡群和鸡舍，且在以下各个环节都需要保留该鉴定信息：

（1）用钝器将鸡蛋圆端敲开。

（2）将鸡蛋的内容物倒入开放的容器中（使蛋黄裸露出来），并用针刺穿蛋黄。

（3）用1毫升不带针头的注射器，从蛋黄开口处抽吸0.5毫升蛋黄。

（4）将抽吸的蛋黄装入一支试管中，然后在相同的试管中加入0.5毫升磷酸盐缓冲溶液，将试管放在架子上。

（5）所有的鸡蛋都取样后，将试管架放置在旋转振荡器上30秒钟。

（6）样本以每分钟2500 rpm的转速（1000xg）离心30分钟。

（7）对于用于保持美国禽群鸡毒支原体和滑液囊支原体净化分类的待检测蛋黄样本，检测离心处理后的蛋黄上清液中是否含有鸡毒支原体和滑液囊支原体应运用指定检测血清和指定的检测免疫球蛋白抗体的试验程序（做这些实验时，可用血清替代离心处理后的蛋黄上清液）。

对于用于美国禽群H5/H7禽流感监测的待检测蛋黄样本，依据《联邦法规汇编》中的要求检测离心处理后的蛋黄上清液。

注意：评估任意蛋黄检测试验的结果时要记住，初始样本配制时是用盐水将蛋黄1∶2稀释的。

8 禽流感标准试验程序

（a）琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验。琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验被视为针对甲型流感病毒抗体的基本筛选试验。琼脂凝胶免疫扩散试验被用来检测针对甲型流感群特异性抗原的循环抗体，即核糖核蛋白（RNP）和基质蛋白（M）。因此，不论它们是哪种亚型毒株，本试验针对甲型流感病毒的抗体均可检测。琼脂凝胶免疫扩散试验也可以作为鉴定甲型禽流感病毒分离菌的群特异性试验。使用的方法和比尔德（Beard）所描述的方法类似。琼脂凝胶免疫扩散试验的基础是抗原和抗体通过琼脂凝胶基质向彼此同时移动。当抗原和特异性抗体接触时，它们会结合形成一种沉淀物，该沉淀物卡在凝胶基质中，形成一条肉眼可见的线条。沉淀物在抗原和抗体浓度最佳的地方形成线条。抗原和抗体相对浓度的变化会使该线条的位置移向孔中浓度最低的地方，或不会形成一条沉淀物线条。电解质浓度、酸碱度、温度和其他变量也会影响沉淀物的形成。

（1）所需材料：冰箱（4℃）；冷冻箱（零下20℃）；用于室温（约25℃）孵育的孵化器或密闭容器；高压灭菌器；加热板/搅拌器和磁力搅拌棒（可选）；真空泵；显微镜照明器或其他合适的光源，用于读取结果；免疫扩散模板切割器、七孔模型（中心孔周围由六个间隔均匀的孔组成）。孔的直径为5.3毫米，间隔2.4毫米；上皿天平（能够测量0.1克的差异）；可吸取50微升溶液的吸移器；常见实验室物品和玻璃器皿—锥形瓶、刻度量筒、移液管、100×15毫米或60×15毫米培养皿、真空软管、支管烧瓶（500毫升或更大）以及一根12或14号平头端插管。

（2）所需试剂：磷酸盐缓冲液（PBS），0.01M，pH7.2（国家兽医服务实验室的培养基#30054或等同物）；琼脂糖（培养基II型中等，西格玛化工有限公司#A-6877或等同物）；美国农业部和官方国家机构批准的禽流感琼脂凝胶免疫扩散抗原和阳性对照血清；美国农业部和官方国家机构批准的强阳性、弱阳性和阴性对照血清。（阴性对照血清可选可不选）。

（3）配制禽流感琼脂凝胶免疫扩散琼脂：向装有1升磷酸盐缓冲溶液（0.01M，pH为7.2）的2升锥形瓶中加入9克琼脂糖和80克氯化钠。

可通过如下方式混合琼脂：将混合物高压灭菌10分钟，从高压灭菌器中取出后，通过旋转的方式进行混合，确保成分均匀混合；在电热板上通过煮沸来溶解混合物，在加热的过程中，用磁力搅拌棒使锥形瓶中的内容物混合。沸腾后，让琼脂在室温（约25℃）下冷却10～15分钟，然后将其转移到培养皿中。

可将琼脂分装成小份（日常工作容积），并在4℃下储存在密闭容器中几周，需要时再将其融化放入培养皿中。注意：当观察到琼脂被杂菌感染或有沉淀物时，请勿使用。

（4）进行琼脂凝胶免疫扩散。（i）检测血清抗体。用容量为25毫升的移液管，将15至17毫升融化的琼脂加入到100×15毫升的培养皿中，或将5至6毫升的琼脂加入到60×15毫升的培养皿中。琼脂的厚度约为2.8毫米。

让平皿在相对无尘的环境中冷却，揭开盖子蒸发出水蒸气。盖子应揭开至少15分钟，但不得超过30分钟，因为水分蒸发可能会改变琼脂电解液的浓度，从而对沉淀物线条有不利影响。注意：倒入琼脂后，应在24小时内使用平皿。

记录样本编号、试剂批号、检测日期和检测及读取检测结果人员。

琼脂硬化后，用模板将琼脂切开。100×15毫米的平板上最多可切出7个模板模式、60×15毫米的平板上最多可切出2个模板模式。

用一根12或14号插管将琼脂胶塞吸开，该插管通过一块硅胶或一根橡胶管连接在支管烧瓶上，烧瓶通过管状物连接在一个真空泵上。调整真空度，以便在取下琼脂塞时，孔周围的琼脂不会受到干扰。

在准备反应孔时，用带有吸头的微量移液管，将50微升禽流感琼脂凝胶免疫扩散抗原加入到位于中心的孔中。将50微升的禽流感琼脂凝胶免疫扩散阳性血清，分别加入到周围三个孔中，且每两个孔之间间隔一个孔，然后在剩余的三个孔中各加入50微升待检血清。这种安排能保证每一份待检血清的旁边都有一个阳性对照组线条，从而为每一份待检血清两侧沉淀物线条的形成做准备（见图1）。注意：一种图案的测试血清孔中可包含阳性、弱阳性和阴性参照血清，以帮助阐释结果（见图2）。

填充完所有的孔后，将所有微孔板都盖起来，让微孔板放入封闭的反应室中防止蒸发，并在室温（大约25℃）下孵育24小时。应在培养室中放一张湿纸巾以保证湿度。注意：移位过程中温度的变化可能会导致不准确的结果。

（ii）解释检测结果。将平皿放在黑色的背景上，取下盖子并检查反应结果，并从下方成一定角度地用光源照亮平皿。显微镜发光器很有帮助，能够调整照明位置和光照强度。

反应的类型将随待检测样本中抗体的浓度而变化。阳性对照血清的沉淀线是读取测试结果的依据。如果该线条不清晰，则试验无效，必须重做。会观察到如下几种类型的反应（见图3）：

阴性反应。在试验样品孔中，对照组线条继续保持原样，而不会弯曲或稍微发生弯曲，远离抗原孔，靠近阳性对照组血清孔。

阳性反应。阳性对照组线条与待检血清和抗原之间的线相结合，或与之形成一条连续的线（同一线）。该线条的位置将取决于待检血清中抗体的浓度。弱阳性样本可能不会在抗原和待检血清之间产生一条完整的沉淀线，但可能只是引起对照组线条末端向内弯曲，靠近待检血清孔。

非特异性线条。偶尔在抗原和待检血清孔之间会观察到这些线。阳性对照组线条会穿过非特异性线条，继续进入待检血清孔。非特异性线条不会与阳性对照组线条形成连续线。

免疫扩散试验（图1），中间孔中加入的是禽流感琼脂凝胶免疫扩散抗原；A和D孔中加入的是禽流感阳性对照血清；B，C，E和F孔中加入的是禽流感阴性测试血清。