树莓酒主发酵期活性成分含量变化及降血脂作用研究

姜燕，于润美，李惠津，张海悦，翟硕

（1.大理大学公共卫生学院，云南大理671000；2.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012；3.吉林省中医药科学院药理所，吉林长春130012）

树莓又称“覆盆子”，蔷薇科悬钩子属浆果植物，其性微温，味甘酸，肾经、归肝，具有补肝益肾、明目之功效[1]。树莓中除了含有丰富的糖、有机酸、维生素C等营养成分，还有黄酮类、树莓酮、多酚类等活性成分具有抗氧化、降血脂能力[2]。树莓果实和叶片中含有黄酮类物质，不仅具有活血化瘀、降血糖、提高免疫功能，而且对细胞损伤具有一定的修复作用。孙金旭等[3]测得树莓总黄酮含量为0.312 mg/mL。总黄酮能明显延长小鼠凝血时间，缩短二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）诱导的血小板聚集肺栓塞所引起呼吸喘促持续的时间；可降低高胆固醇血症动物血清总胆固醇和甘油三酯含量。树莓中树莓酮的含量约为0.014 g/L～0.034 g/L，具有很好的分解转化脂肪的功能。Aspeea[4]等通过高效液相-质谱方法确定了树莓中36种酚类物质包括黄酮苷和单宁的含量，且类黄酮含量较高。

研究树莓酒主发酵期总酚、总黄酮和树莓酮含量的变化以及树莓酒的辅助降血脂作用。树莓发酵制备树莓酒，不仅解决了树莓鲜果不易贮存的问题，改善了鲜果过酸的口感，并且对预防高脂血症和心脑血管疾病具有一定意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“红宝玉”树莓：吉林省白山市玖宏树莓种植基地；安琪葡萄酒果酒专用酵母：湖北省宜昌市安琪酵母有限公司；树莓酮标准品（99.99%）：南通兴成生物制品厂；没食子酸标准品（99.9%）：天津市化学试剂一厂；福林酚：生工生物工程股份有限公司；甲醇、乙醚、芦丁标准品（99.9%）、碳酸氢钠、硫酸钠、氢氧化钠、亚硝酸钠、氯化铝、浓盐酸、碳酸钠（分析纯）：北京化工厂；高脂饲料（其中包含77.5%基础饲料、2%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油、0.2%胆酸钠、0.3%丙硫氧嘧啶）：北京华阜康生物科技股份有限公司；总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）试剂盒：南京建成生物技术有限公司。

1.2 实验动物

SD 大鼠，体重180 g～200 g，雄性。合格证号：SCXK（辽）2015-0001，辽宁长生生物技术有限公司。

1.3 主要仪器与设备

SW-CJ-1F洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；7080全自动生化分析仪：日本日立公司；DL5M离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；M34510解剖器械：天津众美科技开发有限公司；LC-10AT/SeriesⅢ高效液相色谱仪：日本岛津苏州公司/美国科学系统公司；Varian Cary 50紫外可见分光光度计：上海驭锘实业有限公司。

1.4 方法

1.4.1 树莓酒制备工艺流程

树莓→原料分级→清洗→打浆→糖酸调节→接种果酒酵母→发酵→陈酿→澄清→二次调配→罐装→杀菌→产品

1.4.2 标准曲线的绘制

没食子酸标准曲线的绘制：在765nm处测定不同浓度没食子酸标准品的吸光度值[5]，绘制标准曲线并以此计算树莓酒总酚含量。芦丁标准曲线的绘制：在510 nm处测定不同浓度芦丁标准品的吸光度值[6]，绘制标准曲线并以此计算树莓酒总黄酮含量。

树莓酮标准曲线的绘制：准确称取树莓酮标准品0.5 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解定容，混匀，配制成500 μg/mL的标准储备溶液，4℃保存。将树莓酮标准液稀释配制成浓度为 3.20、4.20、6.40、32.00、64.00 μg/mL系列样品，以树莓酮峰面积比值A为纵坐标，以树莓酮的质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线。

1.4.3 树莓酮提取及分析方法

主发酵期每天取10 mL树莓酒于100 mL浓度为99.9%的甲醇溶液中，60℃条件下水浴2 h，过滤后蒸干，用乙醚溶解后，用1%盐酸提取，所得酸水液经碱化后再用乙醚萃取，除去树莓提取物中碱性成分。将分出碱性成分的乙醚液，再分别用5%NaHCO3和2%NaOH萃取，所得水溶液分别酸化后用乙醚萃取，除去提取物中的弱酸性成分和酚性成分。将分出碱性、酸性、酚性成分的树莓提取物乙醚液用水洗至中性，以无水Na2SO4干燥后，加NaHCO3饱和溶液，分出水层，加碱液处理，以乙醚萃取，得到乙醚萃取液，自然挥发掉溶剂，甲醇定容至5 mL，过0.45 μm的微孔滤膜，密封 4 ℃冷藏，备用[7]。

树莓酮采用高效液相色谱分析。色谱条件：Symmetry C18色谱柱（2.0 mm×50 mm，2 μm）。流动相A为水，B 为甲醇；0～5 min等度洗脱：45%A：55%B。流速为 0.5 μL/min，柱温 35 ℃，进样体积 10 μL。

1.4.4 动物造模、分组及给药

树莓酒的降血脂实验按照国家食药监局《辅助降血脂功能评价方法》[8]中的混合型高脂血症检验方法进行。健康成年雄性大鼠60只，适应性喂养5 d，按体重随机分成2组，10只大鼠给予基础饲料作为空白对照组，50只给予高脂饲料作为模型对照组，每周称量体重1次。模型对照组给予高脂饲料2周后，空白对照组和模型对照组大鼠不禁食不禁水，取尾静脉血，采血后尽快分离血清，测定血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。根据血脂水平将模型对照组随机分成4组，分别为模型组、树莓酒0.76 g/kg剂量组、树莓酒0.38 g/kg剂量组、树莓酒0.19 g/kg剂量组。树莓酒各剂量组每日灌胃一次，按10 mL/kg体积灌胃给药，连续给药35 d，灌胃期间各组自由进食和饮水，空白对照组和模型组给予同体积蒸馏水，每周称量一次体重，实验结束时禁食16 h不禁水。测定指标包括：

1）体质量增加量：分别记录大鼠体重量，计算体重增加速度。

2）分别采用试剂盒测定血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C指标。

1.4.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据处理。计量数据用均数±标准差（x±s）表示，组间差异用单因素方差分析，多个样本均数间每两个均数的比较采用Q检验，p＜0.05说明差异有显著性。

2 树莓酒主发酵期活性成分含量的变化

2.1 树莓酒主发酵期总酚含量的变化

酚类物质具有抗氧化和降血脂血糖等作用，并赋予果酒醇厚、丰满、结构感强，后味悠长的特点，提高酒的耐储存能力。果酒的多酚类物质主要有白藜芦醇和没食子酸等[9]。通过没食子酸标准曲线（图1）及回归方程测得树莓酒主发酵期总酚含量的变化如图2所示。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve

在主发酵阶段（第0～8天），随着发酵的进行，在酵母菌的作用下使果实中的总酚进一步浸出，树莓酒中总酚含量逐渐增加，在第6天以后增加速度缓慢，从发酵初期的2.230 g/L提高到2.330 g/L。

图2 树莓酒主发酵期总酚的变化Fig.2 Total phenol content of raspberry wine during primary fermentation period

2.2 树莓酒主发酵期总黄酮含量的变化

芦丁标准曲线如图3所示。

图3 芦丁标准曲线Fig.3 Putin standard curve

拟合的回归方程为y=0.001 1x+0.001 9，相关系数R2=0.999 5。在酵母菌发酵树莓酒的过程中，黄酮含量的变化趋势如图4所示。

图4 树莓酒主发酵期总黄酮的变化Fig.4 Total flavonoid content of raspberry wine during primary fermentation period

在发酵初期黄酮含量增加较快，与发酵过程中酒精含量的增加趋势基本吻合，这是由于酒精有利于黄酮的提取，发酵后期黄酮含量增加速度缓慢，最后基本保持不变。总黄酮含量从0.164 g/L提高到0.298 g/L。

2.3 树莓酒主发酵期树莓酮含量的变化

树莓酮属于芳香类酚类化合物，可以很好的分解转化脂肪，结构与具有减肥和改变脂质代谢辣椒素相似，被称为“天然脂肪转化因子”[6-9]。树莓酮标准曲线如图5所示。

图5 树莓酮标准曲线Fig.5 Raspberry ketone standard curve

拟合的回归方程为y=14.301x-15.13，相关系数R2=0.998。树莓酒主发酵期树莓酮含量的变化见图6。

如图6所示，在发酵过程中，树莓酮含量持续增加，在第5天以后上升缓慢，主发酵结束后其含量从2.300 μg/mL提高到9.456 μg/mL，这是由于随着发酵的进行酒精度增加，利于树莓酮浸提，当酒精度变化缓慢时，树莓酮变化也趋于稳定。

图6 树莓酒主发酵期树莓酮含量的变化Fig.6 Raspberry ketone content of raspberry wine during primary fermentation period

3 树莓酒成品

树莓酒主发酵结束后，经降酸和澄清等工序[10-11]，得到树莓酒成品。依据GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]进行感官和理化指标、卫生检测。成品树莓酒外观性状呈酒红色、透明澄清、无杂质沉淀，具有树莓特有的香味，各项指标均符合国家规定的果酒质量标准。

4 树莓酒辅助降血脂功效

4.1 树莓酒对小鼠体重的影响

不同剂量酒样对大鼠体重的影响见表1。

表1 不同剂量酒样对大鼠体重的影响Table 1 Effects of different doses of raspberry wine on the rats weight

由表1可知，各组大鼠在实验前的初体重以及前3周体重均无明显差异（p＞0.05）。实验第四周以后，高剂量组与模型组相比差异显著（p＜0.05），高剂量组大鼠体重增长缓慢，可能是因为树莓酮通过调解糖脂的代谢紊乱、改善瘦素抵抗和胰岛素抵抗等综合作用来降低肥胖大鼠的体重[13-16]。高脂、高热量饲料会造成动物肥胖，而高剂量树莓酒可以缓解因为高热量造成的体重增长。

4.2 树莓酒对大鼠血脂水平的影响

给予高脂饲料14 d不同剂量酒样对大鼠血脂水平的影响如表2所示。

模型组、树莓酒各剂量组的TC水平、TG含量，与空白对照组比较都有显著性（p＞0.05）。模型组、树莓酒各剂量组LDL-C含量都升高，与空白对照组比较都有极显著性（p＜0.01），模型组、树莓酒各剂量组HDL-C含量，与空白对照组比较无显著性（p＞0.05）。综合判定混合型高脂血症动物模型造模成功。不同剂量酒样对大鼠血脂水平的影响见表3。

由表3可见，树莓酒0.76 g/kg剂量组对TG、TC、LDL-C含量与模型组比较有显著性（p<0.05），模型组和树莓酒各剂量组对HDL-C的影响并不显著（p＞0.05），且各组之间的变化差异也不明显。树莓中含有大量的花青素，研究发现花青素可以使miR-33a和miR-122的表达正常化，miR-33和miR-122可以反馈抑制调节miR-33a的靶基因ABCA1的水平和miR-122的靶基因FAS和PPAR/δ的表达，从而减少肥胖大鼠肝脏胆固醇含量和减少脂肪酸合成[17-20]。树莓酮通过抑制参与脂肪的生成途径，包括过氧化物酶体增殖物活化基因受体G（PPARγ）和CCAAT增强子结合蛋白（C/EBPα）[21-22]，这导致了进一步的脂肪型脂肪酸结合蛋白表达下调（AP2）[23-24]，从而抑制脂肪细胞的基因表达。总之，树莓酒0.76 g/kg剂量组与模型组比较，明显降低高脂血症大鼠血清中各项指标，具有显著性（p＜0.05）。

表2 给予高脂饲料14 d不同剂量酒样对大鼠血脂水平的影响Table 2 Effect of 14 days of high fat diet on serum lipid levels in rats

表3 不同剂量酒样对大鼠血脂水平的影响Table 3 Effect of raspberry wine samples on the lipid levels of hyperlipidemic rats

5 结论

探究树莓酒主发酵期主要活性成分含量的变化及其降血脂活性。在酵母菌的作用下总酚、总黄酮进一步浸出，主发酵结束时总酚、总黄酮和树莓酮含量分别达到 2.330、0.298、9.456 μg/mL。动物实验表明，树莓酒中剂量组0.38 g/kg和低剂量组0.19 g/kg与模型组差异不显著，高剂量组0.76 g/kg与模型组相比差异显著（p＜0.05），树莓酒可以有效抑制高脂大鼠的体重，且明显降低高脂血症大鼠血清中各项指标，说明树莓酒在一定剂量之内具有辅助降血脂功效。